摘要
婴儿期上升遗传性痉挛性麻痹(IAHSP)是一种罕见的早发常染色体隐性运动神经元疾病,以进行性无力和痉挛为特征。在IAHSP患者中已经发现了alsin 2基因(ALS2)的几种突变;然而,相关的患者亚群是ALS2突变阴性的,导致该疾病的致病事件尚不清楚。本研究旨在通过鉴定可能与神经元分化有关的microrna (mirna),更好地了解IAHSP患者运动神经元丢失的分子机制。利用人类诱导多能干细胞(iPSC)技术,我们建立了一个患者特异性的体外细胞模型,并对从ALS2突变阴性IAHSP患者和健康对照中获得的成纤维细胞、iPSC和iPSCs衍生的神经元进行了miRNome分析。我们还分析了两名其他运动神经元疾病患者、两名其他神经系统疾病患者和三名健康对照者的成纤维细胞、iPSCs和iPSCs衍生神经元中选择的差异表达mirna。我们发现,与其他患者和对照组相比,从IAHSP患者获得的细胞培养物中miR-376a, miR-432和miR-451a的表达发生了改变。此外,分层聚类分析显示,miR-451a在成纤维细胞和iPSCs中表达差异,而miR-376a和miR-432在神经元细胞中表达差异。这些结果以及miRNA/mRNA靶分析表明,miR-451a参与干细胞生物学过程,miR-376a和miR-432参与神经元表型的建立。我们的总体研究结果确定了miR-376a, miR-432和miR-451a是参与神经元分化的分子,并可能参与IAHSP的发病机制,这可能为未来开发基于患者特异性mirna的IAHSP或其他运动神经元疾病的治疗策略提供线索。
关键字
alsin,诱导多能干细胞,婴幼儿起病遗传性痉挛性麻痹,microrna,运动神经元疾病
介绍
运动神经元疾病(MND)是一种异质性的神经系统疾病,其特征是运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元进行性和选择性丧失[1],并根据特定的MND受到不同的影响[2]。MND的谱系从儿童期延伸到成年期,临床表现的多样性反映了家族性和散发性MND患者中发现的许多遗传改变[3,4]。
青少年发病的MNDs包括婴儿期发病的上升遗传性痉挛性麻痹(IAHSP),这是一种罕见的致命性疾病,其特征是由于锥体束的选择性严重退变而导致的虚弱和痉挛,在生命的头两年内发病于下肢,并缓慢渐进的上升进化[5]。家族性发病提示常染色体隐性遗传,alsin 2基因(ALS2)的几个突变已被描述[5,6]。该基因编码在运动神经元中大量表达的鸟嘌呤核苷酸交换因子,其突变也与青少年原发性侧索硬化症(通常在生命后期出现)和青少年肌萎缩性侧索硬化症(ALS)有关,其中上肢和下肢运动神经元都参与其中[6]。然而,在相当数量的IAHSP患者中,未发现ALS2编码序列发生突变[7],表明IAHSP是一种遗传异质性综合征。导致IAHSP患者运动神经元进行性丧失的病理生理机制尚未明确。需要进一步的遗传和分子研究来了解IAHSP的发病机制,特别是那些没有发现致病突变的患者。
揭示mnd分子机制的一种方法是从人类样本开始建立体外模型。最近开发的技术允许从患者皮肤成纤维细胞中获得的诱导多能干细胞(iPSCs)进行神经元分化,这为神经系统疾病的体外建模和基因调控网络的发现提供了一个有价值的系统[8-10]。多项研究表明,来自神经系统疾病(包括ALS和脊髓性肌萎缩症(SMA))患者的iPSCs是研究和揭示分子和细胞疾病机制或开发新药的理想的新型患者特异性体外模型[11-21]。这种IAHSP的iPSC模型迄今尚未建立,因此它的发展有望与了解IAHSP的发病机制有关。
在干细胞生物学的背景下,microRNAs (miRNAs)特别令人感兴趣,因为它们参与调节干细胞自我更新、多能性和神经细胞分化[22-27]。mirna已被鉴定为细胞身份的标记,其表达谱明显区分不同的细胞类型[28-30]。此外,在过去几年中,mirna在神经退行性疾病中的作用越来越明显[31-35],特别是在mnd领域[31,34,35]。越来越多的证据表明,mirna是神经退行性疾病的理想生物标志物,既可用于疾病诊断和预后,也可作为潜在的治疗靶点[36]。
在这项研究中,我们对从ALS2突变阴性IAHSP患者和健康对照中获得的成纤维细胞、iPSCs和iPSCs衍生的神经元进行了miRNome分析,以揭示与神经元分化阶段相关的mirna,这些mirna与干细胞多能性和神经元表型相关。与对照细胞相比,在IAHSP细胞中差异表达的选定mirna在成纤维细胞、iPSC和神经细胞培养物中进行了进一步研究,这些培养物来自额外的健康对照、ALS、SMA患者和除mnd(全身性癫痫伴发热性癫痫发作加病症- GEFS)以外的神经疾病患者+以及婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)。我们的研究发现了一种与神经元分化相关的miRNA模式,其表达在IAHSP细胞培养中发生改变,从而为IAHSP发病机制中涉及的miRNA提供了新的见解,可以进一步探索未来针对这种疾病和其他mnd的患者特异性miRNA治疗策略。
材料与方法
试剂和来源公司列在补充表1中。
表1。与对照成纤维细胞、ipsc和ipsc衍生的神经细胞相比,IAHSP中选定的mirna表达失调
microrna的 |
发现阶段 IAHSP和健康对照 |
验证阶段 |
IAHSP对比健康对照一个 |
IAHSP与病理对照b |
成纤维细胞 |
万能 |
神经细胞 |
成纤维细胞 |
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神经细胞 |
成纤维细胞 |
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神经细胞 |
mir - 155 |
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下来 |
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mir - 376 a |
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mir - 432 |
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向上 |
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mir - 451 a |
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下来与mnd; 向上与教你们 |
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mir - 490 |
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mir - 520 |
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mir - 629 |
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mir - 657 |
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mir - 1289 |
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一个健康对照组包括4名没有神经系统疾病的健康受试者;b病理对照包括2例运动神经元疾病(mnd)患者,1例ALS患者和1例SMA患者,以及2例mnd以外的神经系统疾病(NDs)患者,1例全身性癫痫伴发热性癫痫发作(GEFS+), 1例婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)。:理气;:上调;-:不变
患者及临床资料
该研究包括:一名患有IAHSP (omim# 607225)的16岁男孩,临床定义为ALS2基因突变阴性;两名患有MNDs的患者,一名35岁的ALS女性患者(OMIM#105400)和一名3岁的SMA男性患者(OMIM#253300);1名40岁女性患者,患有全身性癫痫伴发热性癫痫发作(GEFS)+) (OMIM#604233)和1名患有婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)的40岁男性(OMIM#607208);3名健康女性(36岁、55岁和60岁)和1名男性(50岁),无神经系统疾病。
获得IAHSP和SMA患者家长、ALS、GEFS的书面知情同意+SMEI患者和健康对照组该研究得到了当地伦理委员会的批准,并根据修订后的赫尔辛基宣言进行。
从所有患者和健康对照中获得成纤维细胞、iPSCs和iPSCs衍生的神经元。来自IAHSP患者和一名健康对照的细胞被纳入miRNome分析和miRNA验证。取自ALS、SMA、GEFS患者的细胞+另外3名健康对照纳入miRNA验证实验。
成纤维细胞培养和iPSC的生成
如前所述[37],从皮肤活检中分离成纤维细胞。细胞在添加20%胎牛血清(FBS)、1% l -谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、100 mM丙酮酸钠和1%青霉素/链霉素(P/S)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中维持和扩增至3-4代。成纤维细胞(2 x104使用STEMCCA Cre-Excisable组成型多顺反子慢病毒重编程和核因子™试剂盒感染细胞),如先前所述[38]。在感染后第25天,人工挑选至少10个iPSC克隆,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养,并在含有20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胚胎干细胞(ESC)培养基中维持,如其他文献所述[39],扩增至3代用于多能状态评估和形态学分析,扩增至20代用于诱导神经细胞分化。所有的实验都是在三个iPSC系上进行的,这些系来自于每个患者和健康对照的三个iPSC克隆。
iPSCs的RNA分离及cDNA合成
用TRIzol试剂从1 ~ 2 × 10范围内提取总RNA6使用2100Nano生物分析仪(Agilent Technologies, Waldbron, Germany)检测iPSCs的质量。使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒逆转录总RNA (100 ng)。
多能性标记的PCR分析
为了证明iPSC的多能性,我们使用Oct4、Sox2、Nanog和Lin-28基因特异性引物,通过PCR扩增了从iPSC系中获得的cDNA,这些基因都是多能性的标记,如前所述[40]。检测GAPDH为管家基因。引物序列见补充表1。PCR产物在DNA透明g - 1%琼脂糖凝胶上电泳。
iPSCs中AKT1和Bcl2的实时PCR检测
为了分析AKT1和Bcl2 mRNA在iPSCs中的表达,利用ViiA7 Real time PCR系统(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)上的AKT1和Bcl2基因特异性Taqman基因表达法扩增cDNA。18s核糖体RNA在对照组和IAHSP细胞中均稳定表达(Ct值标准差< 0.5),并作为内源性对照。靶基因的转录水平以相对值表示(2)——ΔCt)正常化至18s水平。
流式细胞术检测诱导多能干细胞中凋亡细胞的死亡
使用tune NxT声学聚焦细胞仪(Thermo Fisher Scientific)对IAHSP患者和健康对照的两条iPSC细胞系进行了细胞凋亡事件的流式细胞术分析。采用annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对iPSCs进行染色。每个样本至少获得40,000个事件。膜联蛋白v阳性事件被认为是凋亡细胞。使用FlowJo vX.0.7数据分析软件(Tree Star, Ashland, Oregon, USA)进行分析。
神经元前体的生成
将诱导多能干细胞重悬于不含bFGF的人ESC培养基中,并在未处理的低结合培养皿中培养成球,形成胚状体(EBs)。5-6天后,收集EBs,在matrigel包被的培养皿中镀上,在神经元诱导培养基(DMEM/F12) + 1% N-2补充剂和20 ng/mL bFGF中维持4-5天,获得神经花环。然后用添加1% N-2的神经基础培养基替代培养基,10天后获得神经元前体和神经元。为了获得运动神经元,将玫瑰细胞保存在Neurobasal培养基中,添加1% N-2,人工采摘,在matrigel包被的培养皿中,用1 μM环腺苷3 ',5 ' -单磷酸腺苷(cAMP)、1% P/S、0.1 μM维甲酸(RA)和50 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH)培养[39]。粘附的神经祖细胞用1X精确酶分离,并在基质处理的培养皿上进行进一步分析。
免疫荧光
将iPSCs、EBs、神经玫瑰花和神经细胞镀于matrigel处理过的玻璃盖上,进行免疫染色分析。细胞在4%多聚甲醛中室温固定20分钟,0.1% Triton X-100渗透,10%正常山羊血清PBS阻断非特异性结合。用兔抗nanog抗体、小鼠抗sox2抗体和兔抗oct -4抗体、小鼠抗tra -1-60抗体(均为多能性标记)联合培养iPSCs和EBs[40]。为了评估iPSCs的增殖活性,我们用兔抗ki67抗体对其进行染色。用小鼠抗巢蛋白抗体对神经花环进行免疫染色。用小鼠抗β-微管蛋白III (β-TubIII)、小鼠抗微管相关蛋白2 (MAP2)和兔抗同源盒基因Hb9 (Hb9)、小鼠抗神经元核(NeuN)、未成熟运动神经元标志物联合对神经元细胞进行染色。Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG和cy3偶联山羊抗兔IgG二抗显示免疫阳性。细胞用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)反染,盖片用FluorSave贴装。使用激光扫描显微镜(Eclipse TE 2000-E, Nikon, Tokyo)获得共聚焦荧光图像,并使用EZ-C1 3.70成像软件(Nikon)进行分析。抗体细节和工作稀释度汇总在补充表1中。 For alkaline phosphatase colorimetric detection, iPSC cultures were stained with 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate and Nitro Blue Tetrazolium.
iPSCs、EBs和神经元细胞的定量
为了测量iPSC的直径,使用EZ-C1 3.70成像软件(尼康)为3个IAHSP和3个对照iPSC系分别获得100个dapi阳性iPSC克隆。测量每个iPSC克隆的直径,定义为最宽的横向距离,并以均数±标准差(SD)表示。使用Image Pro-Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)计算形成每个iPSC克隆的dapi阳性细胞的数量,并以mean±SD表示。为了评估增殖活性,在免疫荧光染色对Ki67抗原进行特异性染色后,使用Image Pro-Plus (Media Cybernetics)进行细胞计数,对三种IAHSP和三种对照iPSC细胞系各检测50个iPSC克隆。计算每个iPSC克隆中ki67阳性细胞的百分比,相对于dapi阳性细胞/场的总数,并以每个检测组的平均值±SD表示。
对于EB直径测量,使用EZ-C1 3.70成像软件(尼康),从3条IAHSP和3条对照iPSC系衍生的3条EB系中,每条获得10个dapi阳性的EB,大小以mean±SD报告。β-TubIII-和map2阳性神经元在每个覆盖区随机选择四个区域进行计数。对三种IAHSP和三种对照ipsc衍生的神经元细胞系分别进行了两个覆盖分析。每个检测组β-TubIII-和map2阳性细胞/场的总数以mean±SD表示。神经突长度测量,在每个覆盖层随机选择4个视野,人工选择β-TubIII和map2阳性神经元,使用EZ-C1 3.70成像软件(尼康)测量每个选择细胞的最长神经突,并以mean±SD表示。分析了三种IAHSP和对照ipsc衍生的神经元细胞系的两个重叠。对于hb9阳性运动神经元的定量,在每个覆盖的四个随机选择的野上平均计数100个细胞/野。对三种IAHSP和三种对照ipsc衍生的运动神经元细胞系各进行了两个覆盖分析,共30个神经花环。计算hb9阳性运动神经元的百分比与DAPI-和β- tubiii阳性细胞/场的总数的关系,并以均数±标准差表示。
miRNome分析和数据分析
总RNA从1 ~ 2 × 10中提取6使用Megaplex RT引物Human Pool A和B和MultiScribe逆转录酶试剂盒对IAHSP患者和一名健康对照者的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞进行逆转录。将总RNA为500 ng的cDNA与TaqMan Universal PCR Master Mix结合,按照生产厂家的说明,将cDNA分配到TaqMan Human MicroRNA array card A和B v2.0的每个端口。这些阵列在Viia 7快速实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)上运行,一式三份。Human array A和B卡包含381个mirna的引物,包括3个阳性对照mirna和1个阴性对照mirna。将所有结果与U6内源对照进行归一化处理[41,42],并使用ΔCt方法计算相对miRNA表达水平。
实时PCR验证miRNA
选择IAHSP与对照成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞之间差异表达的mirna,根据倍数变化≥3的标准和文献资料,采用实时荧光定量PCR技术进行验证[43——51]。总RNA从1 ~ 2 × 10中提取6IAHSP患者、4名健康对照以及ALS、SMA、GEFS患者的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞+SMEI患者使用TRIzol试剂。采用2100Nano生物分析仪(Agilent Technologies)检测RNA质量。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒对RNA进行逆转录,其引物针对选定的mirna: miR-155, miR-376a, miR-432, miR-451a, miR-490, miR-520, miR-629, miR-657和miR-1289。以U6作为内源对照[41,42]。在Viia 7 Fast real-time PCR System (Thermo Fisher Scientific)上,使用通用PCR主混合物和预先设计的TaqMan MicroRNA检测,通过实时PCR扩增cDNA(相当于总RNA的15 ng),分三次扩增。所有结果均针对U6归一化,并使用ΔCt方法计算相对miRNA表达水平。
预测miRNA-mRNA网络构建
使用DIANA miRNA数据库中的DIANA- microt - cds算法进行miRNA靶标的计算机预测,并使用默认分数截止值[52]。使用Cytoscape 2.8.2版本(http://www.cytoscape.org/),使用ClueGO插件[53],使用代谢途径(KEGG, Biocarta)和基因本体生物学过程术语,对验证的miRNAs的基因靶点进行预测注释。ClueGO将功能术语显示为节点,基于相关基因的相似性,术语之间的关系显示为边缘。术语之间的连通性程度由Cohen的kappa统计计算,使用阈值截断n = 0.4。
实时PCR检测mRNA靶标
通过实时PCR选择mRNA靶标进行验证,每个miRNA考虑三个基因,默认评分截止值为0.9-0.8。RNA,先前从1到2 × 10中提取6IAHSP患者、ALS、SMA、GEFS的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞+使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒逆转录SMEI患者和4名健康对照。采用Taqman基因表达法扩增CAB39、DNAJA1、EIF4B、KMTC2、NDUFAB1、PSMB8、TSC1、TSG101、SMURF1特异性cDNA。18s基因作为内源对照。利用TaqMan Fast Master Mix和Viia 7 Fast real-time PCR System (Thermo Fisher Scientific)上的TaqMan基因检测,通过实时荧光定量PCR扩增cDNA(对应总RNA 10 ng)。所有结果均按18s归一化,相对基因表达水平采用2——ΔCt方法。
统计分析
数据分析使用R Statistical环境(版本3.0.2.)(www.r-statistics.org)进行。采用Mann-Whitney检验比较IAHSP与对照细胞的实验数据。采用Bonferroni校正控制错误发现率。P值< 0.05为显著性。MiRNA数据分析通过MiRNA和样本的分层聚类进行,使用相对表达的平均值转换为log2标度。得到一个热图图来显示聚类结果。通过获得IAHSP患者细胞、所有其他患者和健康对照细胞中miRNA/mRNA相关趋势的“前后图”来评估每种miRNA表达与其mRNA靶标之间的关系。
结果
IAHSP iPSC线的生成
我们通过对IAHSP患者和健康对照的成纤维细胞进行重编程,生成了iPSC系。IAHSP和对照iPSCs均呈碱性磷酸酶阳性(图1A),通常在未分化的多能干细胞中检测到[38],并表达多能性标记物Nanog、Lin-28、Sox2和OCT4[40](图1B/C),表明它们具有多能性。通过直径测量估计,IAHSP iPSCs的尺寸更小,dapi阳性细胞的数量也比对照iPSCs少(p < 0.001)(图1D)。为了评估可能的凋亡事件,我们通过实时PCR评估了凋亡调节因子Bcl2的转录水平(补充图1),并通过流式细胞术估计了膜联蛋白v阳性凋亡细胞的百分比(补充图2):与对照细胞相比,IAHSP iPSCs中Bcl2过表达,IAHSP iPSCs中膜联蛋白v阳性细胞的百分比高于对照iPSCs,但两者的值均未达到显著性。通过免疫荧光,我们发现与对照细胞相比,表达增殖相关Ki67抗原的IAHSP iPSCs比例降低(p < 0.001)(图1E)。此外,与对照细胞相比,IAHSP iPSCs中AKT1的表达水平也有所下降(p < 0.05)(图1F), AKT1是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,是细胞增殖和存活的关键调节因子[54]),这表明来自IAHSP患者的iPSCs的增殖能力和存活能力降低。
图1所示。一代iPSC菌落。对照(上)和IAHSP(下)iPSC菌落的代表性图像,分别通过相衬显微镜(左图)和磷酸酶碱性染色后的亮场显微镜(右图)获得(A)。对照和IAHSP iPSC克隆中多能标记Nanog、Lin-28、Sox2和Oct4以及看家基因GAPDH的PCR表达分析(B)。对照和IAHSP iPSC克隆中Nanog (红色的)及Sox2 (绿色)(上面板),对于Oct4 (红色的)及Sox2 (绿色)(下图),细胞核用DAPI染色(蓝色的) (C)对照和IAHSP iPSC克隆的共聚焦显微镜图像显示细胞核被DAPI染色(蓝色的) (D,左侧面板)。定量从对照(n=3)和IAHSP (n=3) iPSC株系中获得的100个dapi阳性iPSC克隆(D,左图右侧)的直径,定义为最宽的横向距离,以均数±标准差(SD)表示;形成iPSC克隆的dapi阳性细胞数以mean±SD表示(D,右图)。对增殖标志物Ki67 (红色的)和用DAPI (蓝色的) (E,左侧面板)。在50个iPSC对照(n=3)和IAHSP (n=3) iPSC系中,计算ki67阳性细胞的平均百分比±SD与每个克隆的dapi阳性细胞/场总数的关系(E,右侧图表)。Real-time PCR分析对照(白色的酒吧),以及IAHSP (黑条)多能干细胞(n=每组3株iPSC), *p < 0.05;***p < 0.001: Mann-Whitney检验(F)。A、C、D的放大条为80 μm;30 μm in E。
图1Bcl2在对照和IAHSP iPSCs中的表达水平
对照(白色条)和IAHSP(黑色条)iPSCs(每组n = 3个菌落)中Bcl2表达的Real - time-PCR分析。目的基因的转录水平以相对值(2-ΔCt)表示,用18s归一化
图2对照和IAHSP诱导多能干细胞的凋亡事件
使用annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,流式细胞术分析对照组(左列)和IAHSP组(右列)iPSC(每组n = 2株iPSC)的凋亡事件。报告每个样本中膜联蛋白v阳性凋亡细胞的百分比(红色方块)
IAHSP神经元和运动神经元前体的产生
首先,我们诱导IAHSP和对照iPSCs形成EBs(图2A)。通过免疫荧光检测,EBs多能性标记物Sox2、Nanog和Oct4呈阳性[40](图2B/C)。它们在适当的条件下保存5天,随后分化成神经玫瑰花(图2A)。在两组检测中,神经玫瑰花对神经干细胞的特异性标记物巢蛋白(nestin)均表现出免疫反应性[39](图2D)。IAHSP与对照的EBs和神经莲座形态相似,大小无显著差异(图2E)。
图2。诱导多能干细胞向神经元表型细胞的分化。运动神经元分化协议示意图(A)。从对照和IAHSP iPSCs中获得的EBs共聚焦显微镜,Sox2 (绿色)、Nanog (红色的),以及DAPI (蓝色的) (B).共聚焦显微镜下对照和IAHSP ipsc衍生的Sox2阳性EBs (绿色), Oct4 (红色的)及DAPI (蓝色的(C)通过明场显微镜获得的对照和IAHSP EBs的代表性神经花环图像(D,左图);对照组和IAHSP神经花环的共聚焦显微镜图像(绿色)及DAPI (蓝色的) (D,右侧面板)。用DAPI染色的对照和IAHSP iPSCs获得的EBs(上)和神经花环(下)的共聚焦显微镜图像(蓝色的) (E,左侧);从对照(n=3)和IAHSP (n=3) iPSC系中获得的30个EBs和30个神经莲座直径的定量分析(上图)和神经莲座直径(下图),用mean±SD (E,右侧)表示。放大条:所有面板80 μm。
然后将eb衍生的神经莲座在补充N2中维持10天,以获得神经元细胞(图2A)。有趣的是,IAHSP神经花环产生的MAP2-和β- tubiii阳性神经元比例高于对照培养(p < 0.05)(图3A/B)。然而,来自IAHSP iPSCs的神经元显示出比对照神经元更短的神经突,正如神经突长度测量所示(p < 0.001)(图3C)。
图3。诱导多能干细胞向运动神经元的分化。对照和IAHSP ipsc来源的神经元MAP2阳性的共聚焦显微镜图像(红色的), β-TubIII (绿色)及DAPI (蓝色的) (A).在每个对照组(n=3)和IAHSP (n=3) iPSC系衍生的神经元培养中随机选择的四个视野上进行的神经元定量,用β-TubIII和map2阳性细胞总数的平均值±SD表示,*p < 0.05: Mann-Whitney检验(B)。绿色)、map2 (红色的)及DAPI (蓝色的) (C,左侧面板)。在每个对照组(n=3)和IAHSP (n=3)培养中随机选择4个区域测量β-TubIII-和map2阳性神经元的神经突长度,以mean±SD表示,***p < 0.001: Mann-Whitney检验(C,右侧图表)。对照和IAHSP ipsc衍生的运动神经元Hb9阳性的共聚焦显微镜图像(红色的), β-TubIII (绿色)及DAPI (蓝色的(D).对照(n=3)和IAHSP (n=3) iPSC系衍生运动神经元培养(E)中hb9阳性运动神经元相对于dapi阳性(左图)和β- tubiii阳性(右图)细胞/场总数的平均百分比±SD。放大条:所有面板均为80 μm。
为了获得脊髓运动神经元,人工采集IAHSP和对照神经花环,并与RA一起培养以建立尾侧位置,随后根据Erceg及其同事(2010)先前描述的方案添加SHH以促进腹侧位置(图2A)。在分化方案的第50天,IAHSP和对照培养的特点是大量细胞表现出运动特异性表达模式,即Hb9阳性,运动神经元分化过程中诱导的转录因子,以及β-TubIII(图3D)。在IAHSP和对照培养中,hb9阳性运动神经元的百分比没有显著差异(图3E)。
IAHSP成纤维细胞、iPSCs和神经细胞的miRNome谱分析
为了鉴定可能与IAHSP相关的干细胞生物学和神经元分化相关的mirna,我们在IAHSP患者和健康对照的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞中进行了mirna表达谱分析,包括381个人类mirna。在发现阶段,我们发现与对照成纤维细胞相比,IAHSP中有70个mirna表达不同,其中24个mirna上调,46个mirna下调(图4A)。在IAHSP iPSCs中,与对照iPSCs相比,179个mirna表达异常,其中77个mirna表达上调,102个mirna表达下调(图4B)。此外,与对照细胞相比,IAHSP神经元细胞中有262个mirna差异表达,其中32个mirna上调,230个mirna下调(图4C)。
图4。对照和IAHSP成纤维细胞、ipsc和ipsc衍生的神经细胞中miRNA表达谱的热图表示。对照和IAHSP成纤维细胞(A)、iPSCs (B)和神经元细胞(C)中差异表达的mirna表达水平的比较,与U6内源性对照进行归一化并使用ΔCt方法计算。在彩虹刻度颜色中,蓝色表示IAHSP细胞中mirna的下调,红色表示与对照培养物相比,IAHSP细胞中mirna的上调。
与对照培养物相比,在IAHSP中差异表达的mirna中,我们根据倍数变化值大于3以及它们在干细胞生物学和运动神经元疾病中的已知作用,选择了9个mirna进行验证:miR-155、miR-376a、miR-432、miR-451a、miR-490、miR-520、miR-629、miR-657和miR-1289。miRNome分析这些分子表达的数据显示:i)与对照细胞相比,IAHSP成纤维细胞中的miR-376a、miR-451a和miR-629下调(图4A和表1);ii)与对照iPSCs相比,IAHSP iPSCs中miR-155、miR-376a、miR-490和miR-520下调,而miR-432和miR-451a上调(图4B和表1);iii)与对照细胞相比,IAHSP神经元细胞中miR-155、miR-376a和miR-432下调,而miR-520、miR-629和miR-1289上调(图4C和表1)。
IAHSP和对照细胞之间miRNA表达的差异与成纤维细胞分离和重编程效率的差异无关,因为从2x10获得的成纤维细胞形态和iPSC菌落数量不同4重编程成纤维细胞(8至10个菌落)在检测的样品组之间具有可比性(~ 0.2%的效率)。
miRNA验证:鉴定miR-376a、miR-432和miR-451a是IAHSP中神经元分化的调节剂
为了验证miRNoma谱分析的数据,通过实时PCR分析了9个选定的mirna,分别来自IAHSP患者和处于发现阶段的健康对照的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞,以及来自另外3名健康对照的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞,其中两名患有mnd的患者(一名患有ALS,一名患有SMA),以及两名患有不同于mnd的神经系统疾病的患者(GEFS)+和SMEI(补充图3/4)。验证阶段的结果显示,与健康对照、MND、GEFS的成纤维细胞相比,IAHSP成纤维细胞中的miR-451a表达降低+和SMEI患者(图5),与之前的miRNome分析数据一致,而miR-376a和miR-629水平在分析的所有成纤维细胞培养物中相似(补充图5和表1)。在iPSCs中,与健康对照GEFS相比,IAHSP中miR-451a上调+和SMEI细胞,证实了miRNome分析结果,但与MND iPSCs相比,它被下调(图5和表1)。所有其他mirna, miR-155, miR-376a, miR-432, miR-520和miR-490,其表达在发现阶段发生改变,在分析的iPSC样本中未检测到或以相似的水平表达(补充图5和表1)。神经元细胞中mirna的验证显示,与所有其他样本相比,IAHSP中miR-376a和miR-432的含量显著降低(图5和表1),与发现阶段的数据一致。相反,在IAHSP神经元细胞中miR-155下调未被证实,miR-520、miR-629和miR-1289上调未被证实。事实上,miR-155和miR-520在IAHSP、SMA和健康对照细胞中表达水平相似,而在ALS、GEFS中未检测到+SMEI细胞;与所有分析的神经元样本相比,miR-629在IAHSP中的表达相似;在所有培养物中均未检测到miR-1289(补充图5)。
图5。在健康对照、病理对照和IAHSP成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞培养物中验证的miRNA (miR-376a、miR-432、miR-451a)表达的热图表示.比较验证mirna miR-376a、miR-432和miR-451a在4名无神经系统疾病的健康受试者、2名运动神经元疾病(mnd)患者、1名ALS患者和1名SMA患者、2名mnd以外的神经系统疾病患者、1名全身性癫痫伴发热性癫痫发作(GEFS+)患者和1名婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)患者的成纤维细胞、iPSC和神经元细胞中的表达水平。mirna水平报告为log2转化的相对表达,并与U6内源对照进行归一化。彩虹色代表了从负(浅青色)到正(品红)的表达水平值。
图3通过重编程家族性癫痫患者成纤维细胞(GEFS+和SMEI)生成iPSCs和EBs
来自健康对照和2例家族性癫痫患者的iPSC克隆的代表性图像,其中1例为全身性癫痫伴热性发作+ (GEFS+), 1例为婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI) (A)。来自健康对照和GEFS+和SMEI患者的iPSC克隆衍生EBs的代表性图像。放大倍数:80 μm
补充图4通过重编程来自运动神经元疾病(ALS和SMA)患者的成纤维细胞生成iPSCs和神经元前体细胞
(A)从SMA患者的成纤维细胞中获得的干细胞标记物TRA-1-60(红色),SOX2(绿色)阳性的iPSC集落的代表性图像。从ALS和健康受试者的成纤维细胞中也获得了iPSCs。(B)从B -tub(红色)和NeuN(绿色)阳性的SMA iPSCs中获得的神经前体的代表性图像。从ALS和健康的iPSCs中也获得了神经前体。细胞核用DAPI染色(蓝色)。比例尺:70 μm
综上所述,这些数据确定了miR-376a、miR-432和miR-451a在IAHSP成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞中的表达谱,与来自健康对照和ALS、SMA、SMEI和GEFS患者的相应细胞培养物相比,miR-376a、miR-432和miR-451a的表达谱有所改变+(图5和表1)有趣的是,分层聚类分析显示,与健康对照、ALS、SMA、SMEI和GEFS相比,IAHSP样本具有明显的miRNA聚类特征+这表明所鉴定的mirna的表达改变可能有助于IAHSP的发病机制。与所有其他样本相比,ALS和SMA的一个独特的子簇也被披露,导致了miR-376a, miR-432和miR-451a表达水平的精细平衡可能在mnd中至关重要的假设。值得注意的是,分层聚类分析还揭示了两种不同的mirna簇,一种表征成纤维细胞和iPSCs,包括miR-451a,另一种与神经元细胞表型相关,包括miR-376a和miR-432。这些结果表明,miR-451a特异性参与干细胞生物学过程,而miR-376a和miR-432参与神经元分化过程。
miRNA靶标预测及功能网络构建
我们构建了一个网络来可视化miR-376a、miR-432和miR-451a及其预测靶点的功能连接,以及参与运动神经元疾病相关过程的注释(图6)。miR-376通过调节EIF4A1和2、EIF4B、NUP58和160、TGS1基因来调节RNA转运(i);ii)内质网中与n -聚糖生物合成密切相关的蛋白质加工,通过调节MAN1C1、DNAJA1和SEC24D;iii)氧化磷酸化,通过调节ATP6V1G1、NDUFAB1和sddd与吞噬体和突触囊泡周期相关。miR-432参与:i) gaba能突触通路,包括cAMP信号,通过靶向GABRB1和GABBR1基因;ii)赖氨酸降解,通过靶向WHSC1L1和KMT2C基因;iii)内吞作用,通过靶向EPN3, PIP5K1B, TSG101, SMURF。miR-451a及其推测的靶基因CAB39和结节性硬化症1 (TSC1)与mTOR信号通路有关,与AMPK和P13K-Akt信号通路密切相关;同样的miRNA,连同miR-376a,也通过靶向PSMA1、6和PSMB8基因与蛋白酶体相关。
图6。验证miRNA (miR-376a, miR-432, miR-451a)及其预测基因靶标的功能注释网络表示。与mTOR信号通路有关的基因靶点(红色椭圆)、蛋白酶体(橙色椭圆形)、gabaergy突触(蓝色椭圆)、赖氨酸降解(粉红色的椭圆),内质网的蛋白质加工(绿色的椭圆),以及氧化磷酸化(浅蓝色椭圆)是根据他们的计算机预测(灰色虚线箭头).mirna (miR-451a, miR-432和miR-376a),黄色方块)和预测的基因靶点(ATP6V1G1、CAB39、DNAJA1、EIF4A1、EIF4A2、EIF4B、EPN3、MAN1C1、NDUFAB1、NUP58、NUP160、PIP5K1B、PSMA1、PSMA6、PSMNB8、sddd、SMURF1、SEC24D、TGS101、TSC101、WHSC1L1、KMT2C、白色圆圈)如图所示,使用Cytoscape软件通过ClueGO插件构建。
miR-376a、miR-432和miR-451a mRNA靶点的表达分析
在IAHSP患者、ALS、SMA、SMEI和GEFS的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞中,分析miR-376a、miR-432和miR-451a选定的假定靶基因的转录水平+病人和健康对照组具体来说,在iPSCs和成纤维细胞中,我们分析了CAB39、TSC1和PSMB8作为miR-451a的靶点(图7A和B);在神经元细胞中,DNAJA1、EIF4B和NDUFAB1被测试为miR-376a的靶点,SMURF、TSG101和KMT2C被测试为miR-432的靶点(图7C)。
图7。在IAHSP患者的成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞(黑色方框)、ALS(白色圆圈)、SMA(白色方框)、SMEI(黑色三角形)和GEFS中分析miR-376a、miR-432和miR-451a选定基因靶点的转录水平+(白色三角形)为患者,而健康对照(黑色和白色圆圈)为健康对照。通过获得IAHSP患者细胞中与所有其他患者和健康对照相比的miRNA/mRNA相关趋势的“前后图”来评估每种miRNA及其mRNA靶点的表达之间的关系。在IAHSP、ALS、SMA、SMEI和GEFS中,靶基因在18s内源对照下表达正常化,并使用ΔCt方法计算表达水平+并控制成纤维细胞、多能干细胞和神经细胞。(A) miR-451a及其与成纤维细胞中其靶点CAB39、TSC1和PSMB8表达的关系。(B) miR-451a及其与iPSCs中其靶点CAB39表达的关系。(C)上图,miR-376a及其与神经元中其靶点DNAJA1、EIF4B、NDUFAB1表达的关系。下图为神经元细胞中miR-432及其靶点SMURF、TSG101、KMT2C表达的关系。
在ALS、SMA、SMEI和GEFS的成纤维细胞和iPSCs(仅TSC1)中,miR-451a的表达与其靶点CAB39和TSC1的表达呈负相关+而在IAHSP患者的相应细胞中,CAB39和TSC1水平均高于miRNA,呈正相关趋势。在所有成纤维细胞样本中,PSMB8 mRNA水平低于miR-451a, IAHSP成纤维细胞的miR-451a表达水平较低(图7A和B)。
miR-376a在IAHSP患者的神经元细胞中与其靶点DNAJA1和NUDFAB1的表达呈正相关,而在ALS、SMA、SMEI和GEFS的相应细胞中则无正相关+患者和对照组(图7C)。在所有患者和对照组的相同细胞中,EIF4B mRNA水平与miR-376a mRNA水平呈负相关趋势。然而,IAHSP患者的神经元中miR-376a和EIF4B的表达水平较低。在IAHSP患者的神经细胞中,miR-432与tsg101表达水平呈正相关趋势,而在其他患者和对照组的细胞中,miR-432与tsg101表达水平呈正相关。在所有样本中,miR-432水平与SMURF和KMT2C水平呈负相关趋势,IAHSP患者的神经元显示miRNA及其靶点的表达水平较低(图7C)。
所有这些数据表明,IAHSP细胞中miR-376a、miR-432和miR-451a的表达失调可能导致参与干细胞生物学过程和神经元分化的关键基因,特别是TSC1、TSG101、DNAJA1和NDUFAB1的表达模式改变,这些基因的平衡可能对IAHSP特异性神经退行性过程至关重要。
讨论
包括IAHSP在内的MNDs在遗传背景和临床表现方面是复杂的神经退行性疾病。在IAHSP患者中已经发现了ALS2位点的几个突变,但在运动神经元缺陷的机制尚不清楚的相关患者亚群中未发现遗传改变。值得注意的是,即使在本文研究的IAHSP患者中没有追踪到ALS2基因突变,与所有其他疾病和健康对照相比,IAHSP衍生的神经细胞中的基因转录表达水平下调(补充图6)。这表明可能发生了转录调节的改变,这是IAHSP和其他ALS2基因相关疾病中组合基因控制机制复杂性的基础。
图5。健康对照、病理对照、IAHSP成纤维细胞、iPSCs和神经元细胞中未验证mirna表达水平的热图
未验证的mirna在成纤维细胞(绿色)、iPSCs(红色)和神经元细胞(橙色)中具有相似表达水平的热图,这些mirna来自四名健康受试者,两名运动神经元疾病(mnd)患者,一名ALS患者和一名SMA患者,以及两名受mnd以外神经系统疾病影响的患者,一名全身性癫痫伴发热性癫痫发作(GEFS+),一名婴儿期严重肌阵挛性癫痫(SMEI)。mirna水平报告为log2转化的相对表达,并与U6内源对照进行归一化。彩虹色代表了从负(浅青色)到正(品红)的表达水平值。白框表示未检测到的mirna
补充图6。ALS2基因在IAHSP神经元细胞中的表达水平。IAHSP患者iPSCs神经元细胞中ALS2基因的转录表达分析(黑色直方图)、ALS(浅灰色直方图)、SMA(灰色直方图)、SMEI(深灰色直方图)、GEFS+(深灰色直方图)和对照组(白色直方图)的表达水平表示为相对值(2-ΔCt),并以内源性对照18归一化,一式三份。ALS2基因表达水平低于健康对照组、ALS、SMA、SMEI和GEFS+细胞。这表明ALS2基因的转录调控可能发生了改变,这是IAHSP和其他ALS2基因相关疾病中组合基因控制机制复杂性的基础
将MND患者的成纤维细胞重编程为iPSCs,并将其分化为神经元,可为研究疾病的分子机制提供患者特异性细胞模型[18]。据我们所知,IAHSP患者的iPSC尚未被生成和研究以探讨致病机制或可能的治疗干预措施,因此是否存在与IAHSP iPSC身份相关的关键分子或参与该疾病的神经元分化和致病过程尚不清楚。众所周知,mirna参与了干细胞功能和神经退行性变[22,55,56],因此,mirna是被怀疑在mnd致病事件中发挥作用的最有可能的候选分子之一。然而,它们在IAHSP中的作用仍未被探索。
在这里,我们对来自ALS2突变阴性IAHSP患者和健康对照的成纤维细胞、ipsc和ipsc衍生的神经细胞中的381个人类mirna进行了mirna谱分析,以揭示IAHSP细胞中差异表达的mirna,并可能与该疾病有关。验证来自其他健康对照、受不同mnd (ALS和SMA)影响的患者以及非mnd (SMEI和GEFS)的神经系统疾病的细胞培养物中选定的mirna+),揭示了与神经元分化特异性相关的miRNA模式,并可能与IAHSP有关。
我们对发育轴“成纤维细胞- ipsc -神经元细胞”的分子分析有力地证明了表征患者来源的细胞类型与鉴定IAHSP和其他mnd的分子基础的相关性。
与对照iPSCs相比,IAHSP患者产生的iPSCs尺寸减小,同时增殖能力下降,表明患者来源的细胞内在存活特性存在疾病相关差异。然而,这种差异并没有反映在成纤维细胞重编程的不同效率上;事实上,在两组中,成纤维细胞形态和ipsc衍生的菌落数量是相似的。
分析IAHSP和对照成纤维细胞中的miRNome,并进一步验证其他疾病对照- ALS, SMA, SMEI和GEFS的成纤维细胞培养中选定的mirna+结果表明,与所有其他样本相比,IAHSP成纤维细胞中miR-451a的表达降低。相反,与对照细胞和来自SMEI和GEFS的细胞相比,IAHSP成纤维细胞衍生的iPSCs中该miRNA增加+但与肌萎缩侧索硬化症和肌萎缩侧索硬化症患者的细胞相比,情况并非如此。我们通过miRNA- mrna靶点网络构建探索miR-451的功能,发现该miRNA通过靶向TSC1基因,推测调控与细胞周期调控相关的mTOR、AMPK和PI3K-Akt信号通路[27]。因此,我们的mRNA表达分析显示,在iPSCs中miR-451a和TSC1基因水平呈正相关趋势。癌症领域的研究证实了miR-451a对这一途径的调控,这些研究表明,miR-451a通过激活mTOR/AMPK/PI3K-Akt信号,通过直接靶向TSC1,增强stemness特征[57]。根据这些文献数据和观察到的mRNA靶标趋势,与成纤维细胞阶段相比,miR-451a在IAHPS iPSC中的上调可能与其促进自我更新能力和多能细胞标记物的表达能力有关,实际上是iPSC分化阶段的特征。我们的基因表达分析也证明了miR-451a和AKT1 mRNA水平之间的反比关系,这表明我们在IAHSP iPSCs中观察到的细胞大小改变和增殖活性降低可能与miR-451a依赖性的AKT1表达降低有关,而AKT1可以促进增殖,提高细胞存活率[54]。此外,我们对miR-451的miRNA-mRNA研究发现蛋白酶体亚单位β 8 (PSMB8)基因是另一个潜在靶标。PSMB8在去除错误折叠和受损蛋白,控制细胞完整性和细胞活力方面发挥重要作用[58]。有趣的是,在IAHSP中,以及在ALS和SMA细胞中,miR-451a的表达水平比对照样本和其他神经系统疾病样本更高,这表明蛋白质质量控制的调节发生了改变,而这实际上在mnd中起着至关重要的作用[59]。
ipsc衍生神经元的miRNA分析显示,与所有其他细胞相比,IAHSP神经元细胞中的miR-376a和miR-432减少。大量数据表明,与TDP-43突变相关的mnd中RNA加工和细胞内运输发生改变,TDP-43是miRNA生物发生所需的蛋白质[60,61]。有趣的是,miR-376a与RNA转运途径相关基因(即EIF4A1和2,EIF4B, NUP58和160,TGS1)之间的假定关系表明,该miRNA不仅在tdp -43相关的mnd中,而且在其他mnd(如IAHSP)中,都有助于改变RNA代谢。此外,通过预测的功能网络,我们发现氧化磷酸化途径是miR-376a的额外潜在靶点。根据NDUFAB1基因,它编码一个亚基复杂的我线粒体的呼吸链,与miR-376a呈正相关趋势。由于氧化应激和线粒体功能在包括ALS在内的mnd发病机制中众所周知的作用,特别是考虑到抗氧化剂是该疾病的潜在治疗剂,因此这一观察结果特别有趣[62,63]。
大量研究表明,更好地了解内质网途径中的蛋白质加工对于理解发病机制并最终设计神经退行性疾病的治疗方法是有价值的[64,65]。我们的预测分析显示,miR-376a与内质网相关通路中涉及的基因(即MAN1C1、DNAJA1和SEC24D)之间存在假定的关系。在IAHSP神经元细胞中,miR-376a与DNAJA1基因的miRNA/mRNA正相关也支持了这一点,提示miR-376a也可能与mnd中错误折叠和受损的蛋白质修复机制有关。值得注意的是,乔维奇,等.在大鼠原代培养中,miR-376a在功能神经元中富集,并诱导干细胞向神经元表型分化[66]。根据这些数据和ipsc衍生的神经元细胞特性,我们假设miR-376a表达水平的降低可能是神经元表型改变的原因,其特征是神经突生长受损。在这方面,需要进一步的研究来了解这种缺陷是否与RNA代谢改变有关,还是与非alsin介导的轴突运输改变有关。
关于miR-432,我们的网络分析显示gaba能突触、赖氨酸降解和内吞途径是推测的miR-432调节机制。有趣的是,mirna在调节内体毒性和突触囊泡循环途径之间的相互作用中的作用已被描述[67,68]。在这里,我们认为miR-432可能在这些通路中发挥关键作用,这些通路广泛涉及MND,如ALS的发生和进展[68,69]。此外,研究表明,miR-432通过靶向巢蛋白、协同抑制因子1和甲基cpg结合蛋白2,诱导人神经母细胞瘤细胞的神经突生长、增殖抑制和细胞周期阻滞[49]。这些结果表明miR-432参与神经细胞发生过程,并表明该miRNA的表达缺陷,可能与miR-376一起,可能通过损害神经突生长而对神经元细胞分化产生负面影响。最后,我们在IAHSP神经元细胞中发现miR-432的表达降低,这与TSG101基因呈正相关,TSG101基因作为负生长调节剂,可能是IAHSP培养物中观察到的神经元数量不同于对照组的原因。
结论
我们的总体数据表明,miR-451a、miR-376a和miR-432与成纤维细胞向ipsc衍生的神经元的分化程序密切相关,并且作为表达改变可能显著影响与mnd相关过程相关的信号通路的分子。有趣的是,对“成纤维细胞- ipsc -神经元”轴中miRNA表达水平的分层聚类分析揭示了两个miRNA簇:第一个包括miR-451a在内的miRNA簇是成纤维细胞和iPSCS所独有的,表明miR-451对干细胞生物学过程的贡献;第二种,包括miR-376a和miR-432,与神经元细胞表型相关,突出了这些mirna在调节神经元分化程序中的作用。我们关于在ipsc为基础的IAHSP体外模型中miR-451a、miR-376a和miR-431表达模式失调的研究结果为IAHSP的发病机制提供了新的见解,指出依赖于这些mirna的神经元分化过程的改变可能最终导致IAHSP疾病中运动神经元的可用性改变。在基因定义或未定义的IAHSP患者和其他mnd中进一步研究,有助于深入了解miR-376a、miR-432和miR-451a在疾病发生和/或进展中的协同作用,有助于未来开发基于患者特异性mirna的IAHSP和其他mnd治疗策略。
致谢
我们非常感谢E. Ciusani博士(临床病理和医学遗传学实验室,Fondazione Istituto Neurologico“Carlo Besta”,意大利米兰)赠送的annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术分析的有益建议。
资金
这项工作得到了意大利卫生部年度研究基金(RC2013/LR3、RC2014/LR3、RC2015/LR1、RC2016/LR1、RC2017/LR1)和伦巴第大区(8598/Ricerca Indipendente 2009)对RM的资助;区域生物医学基金会;TRANS_ALS,资助号2015-0023);由Cariplo基金会资助SB, FRRB保留给内科科学家(ALS的一个步骤,Cariplo 2017- Rif. 2017-1886)。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
查看补充数据
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