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摘要gydF4y2Ba

利巴沙酶是一种口服β-内酰胺酶，旨在与静脉注射β-内酰胺类抗生素(青霉素类和头孢菌素类)共同使用，以保护肠道微生物组免受过量抗生素排泄到胃肠道。在一项安慰剂对照的跨国公司2b期概念证明临床研究中，利巴唑酶显著降低了发病率gydF4y2Ba艰难梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba使用头孢曲松治疗下呼吸道感染的患者感染。根据临床医生的决定，患者也可以接受大环内酯类药物的治疗。在临床研究中，收集了三个连续的粪便样本，用于肠道微生物组分析和某些病原体的肠道定植的微生物测定。利用16S rRNA基因测序分析肠道微生物组的变化。与安慰剂组相比，利巴唑酶显著改善了α和β多样性的损失。在临床研究中，明显有更多的安慰剂患者新定植了万古霉素耐药肠球菌(VRE)，目前的微生物组分析确定，明显有更多的安慰剂患者也成为了肠球菌的单一优势(15比4)。值得注意的是，与非定植患者相比，VRE定植的患者肠道微生物组α多样性显著减少。这些数据表明，利巴沙酶限制抗生素介导的头孢曲松治疗患者肠道微生物组的损伤，并支持进一步的临床开发。利巴唑酶是一种独特的肠道微生物保护剂，旨在减少机会性感染gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba在静脉接受β-内酰胺类抗生素的患者中。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

β-内酰胺酶，头孢曲松，临床研究，肠道菌群保护剂gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

肠道微生物群对人类健康很重要，提供了对机会性病原体的定植抗性gydF4y2Ba艰难梭状芽胞杆菌gydF4y2Ba[1 - 3]。当肠道菌群的平衡被打乱时，定植抗性就会丧失，从而导致病原体过度生长，可能导致感染[1,4]。定植抗性的机制已经有很好的文献记载gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba当肠道细菌将初级胆盐代谢为次级胆盐时，次级胆盐反过来又抑制了胆汁酸的萌发gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba孢子[5]。当这些有益细菌，其中大多数是专性厌氧菌，失去了，也就失去了抑制gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba发芽。因此，肠道微生物组组成的改变存在gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba孢子可产生暴雷gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba感染(CDI)[6]。gydF4y2Ba

抗生素是肠道微生物组破坏的主要原因，广谱抗菌素与CDI风险增加密切相关[6-8]，包括克林霉素、氟喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素(青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类)[2,6,9-12]。所有静脉(IV) β-内酰胺类抗生素至少在肝脏中经过部分处理，并作为活性抗菌素[13]通过胆汁排出肠道。β-内酰胺的胆道排泄量从输入剂量的一小部分到头孢曲松[13]等抗生素的40%不等，导致肠内[14]浓度高达1mg /ml。β-内酰胺是最常用的广谱抗生素，对肠道菌群中的共生生物尤其有害，特别是对在定殖耐药性[9]中起作用的有益厌氧菌。gydF4y2Ba

虽然抗生素仍然是治疗细菌感染的主要手段，但它们的使用会显著增加肠道微生物组受损的风险，导致CDI等感染的发展。抗生素治疗的持续时间、使用不同类型抗生素的数量和CDI风险之间的相关性显示，较长的疗程和使用多种抗生素显著增加CDI[10]的风险。因此，限制微生物组暴露于抗生素将减少微生物组的破坏，并提供一种有益的策略，以减少抗生素相关感染的发生率，如CDI。gydF4y2Ba

利巴唑酶是一种口服β-内酰胺酶，打算与静脉注射青霉素和头孢菌素[15]共给药。利巴唑酶的释放pH值为5.5，即胆汁释放部位小肠上部的pH值[16]。预防策略是有足够的活性β-内酰胺酶可降解多余的β-内酰胺，因为它们被排泄到肠腔，在到达和伤害结肠菌群之前。除了与肠道微生物群失调[17]相关的其他负面健康影响外，对肠道微生物群的保护有望维持定殖耐药性并防止CDI等机会性感染。gydF4y2Ba

在几项研究中，利巴唑酶进行了临床评估。在1期临床研究中，口服利巴唑酶耐受性良好，口服[18]时仍停留在肠腔内。2a期临床研究证实了利巴沙酶的作用机制，证明口服利巴沙酶和静脉注射头孢曲松联合给药可导致肠道食糜中头孢曲松消除到无法检测的水平[14]。重要的是，利巴唑酶不影响头孢曲松的血药浓度，这与活性酶残留在肠腔的发现一致。gydF4y2Ba

基于这些有希望的临床结果，在412名住院治疗下呼吸道感染(LRTI)的患者中进行了2b期概念验证研究。患者随机一对一接受利巴唑酶或安慰剂联合治疗。除了按照当地方案给予头孢曲松外，患者还可以根据主治医生的要求接受大环内酯类药物。研究给药开始于第一次注射头孢曲松前30分钟，且不晚于第二次注射头孢曲松前，并在最后一次给药后72小时持续给药，以确保有足够的酶灭活排泄到肠道的残留抗生素。对患者进行腹泻监测，然后在头孢曲松初级疗程期间及6周后检测CDI。该研究达到了其主要终点，即与安慰剂相比，接受利巴唑酶的患者的CDI发生率显著降低。安慰剂组患者中有3.4%被诊断为CDI，而利巴沙酶组患者中只有1.0%被诊断为CDI(风险降低2.4%，95% CI -0.6至5.9;单侧p=0.045)，包括027株[20]引起的CDI[19]的发生率降低了71%。gydF4y2Ba

在2b期研究中，在三个指定点收集粪便样本，并使用16S rRNA基因测序分析，以评估粪便微生物群的变化作为肠道微生物群变化的代表。在这里，我们报道了该分析的结果，并证明，与预期的作用机制一致，利巴沙酶似乎可以保护头孢曲松治疗患者的肠道微生物组免受抗生素介导的损伤。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

临床研究(样本来源)gydF4y2Ba

2015年11月至2016年11月，利巴唑酶进行了2b期概念证明研究(NCT02563106)[19]。该研究招募了412名患者(平均年龄70岁)，主要来自东欧，他们因LRTI而入院接受头孢曲松治疗。患者随机1:1接受头孢曲松加利巴唑酶或头孢曲松加安慰剂。该研究的一个关键入选标准是，患者预计将接受至少5天的头孢曲松治疗。研究药物在头孢曲松治疗期间及治疗后72小时内给予(图1)。两组均接受类似的头孢曲松治疗，利巴唑酶组的平均总剂量为18.9 g，安慰剂组为17.7 g，两组的中位数和平均值分别为11.0天。患者也可以根据治疗医师的自行决定接受大环内酯类药物。在研究期间，每个治疗组中接受额外大环内酯治疗的患者数量相似，利巴唑酶组76例(36.9%)，安慰剂组72例(35.0%)。头孢曲松治疗后随访患者腹泻和CDI发生6周。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba利巴唑酶2b期临床研究设计示意图。患者被纳入研究，随机1:1接受利巴沙酶(150mg)或安慰剂治疗q.i.d.在头孢曲松治疗LRTI期间(治疗期1,5 -14天)。在完成头孢曲松静脉治疗后，患者继续接受他们指定的研究药物额外72小时(治疗期2)。患者额外随访了6周的腹泻和CDI。在三个预先指定的点收集粪便样本，用于特定病原体定植的微生物测定和微生物组分析。这些样品的收集方法如图中白色条所示gydF4y2BaT0gydF4y2Ba、筛选;gydF4y2BaT1gydF4y2Ba，治疗2期的结论gydF4y2BaT2gydF4y2Ba随访4周gydF4y2Ba

抽样gydF4y2Ba

在研究过程中，预计将从所有参与者的三个指定点收集粪便样本，用于微生物组分析和细菌定植与某些病原体(如万古霉素耐药肠球菌[VRE])的微生物测定。这些样本将在筛选期间收集(gydF4y2BaT0gydF4y2Ba图1)，在头孢曲松治疗72小时后和研究药物治疗结束时的临床访问中(gydF4y2BaT1gydF4y2Ba)和为期4周的随访(gydF4y2BaT2gydF4y2Ba)．样本包括直肠或新鲜粪便拭子(BD eSwab收集试剂盒)，用于微生物学评估定植，以及Omnigene肠道收集管(DNA Genotek，渥太华，加拿大)收集的新鲜粪便样本，作为肠道微生物组的代表。两种样本类型都被送往一个中心实验室(ACM Global)，在那里直肠拭子被镀在选择性培养基上，以评估病原体的存在，用于微生物组分析的粪便样本被冷冻以供后续分析。gydF4y2Ba

DNA提取和测序gydF4y2Ba

冷冻粪便样本送DNA Genotek进行DNA提取、16S rRNA基因测序和数据分析。所有程序都按照DNA基因泰克的协议执行。简单地说，DNA被提取和量化，并使用Illumina公司的nextaxt协议进行文库准备。在Illumina MiSeq平台上进行扩增子测序，在翠鸟自动化平台上使用MoBio PowerMag分离试剂盒提取DNA。库准备使用了Illumina公司Nextera XT协议的定制双索引版本。16S核糖体亚基的V3-V4区用定制的聚合酶链式反应引物扩增，并在Illumina MiSeq上测序。gydF4y2Ba

对原始测序reads进行Read合并和质量过滤，以消除任何测序伪影和低质量reads。采用FLASh算法[21]对低质量序列进行读合并和自动拒绝;长度和模糊基的质量筛选使用专有脚本进行。利用策划分类法数据库对测序结果进行分类。进行了封闭参考分类法分类，其中每个序列都与策划的SILVA版本123参考数据库[22]对齐。使用版本1.5.1[23]的NINJA-OPS算法在97%序列一致性下对齐序列。为了消除测序深度方差的影响，所有样本被细化到每个样本25,000个分类序列，每个样本少于25,000个分类序列的样本被纳入完整的操作分类单元(OTU)表，但被排除在进一步的分析之外。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

本研究提供的元数据与下文所述的研究目标结合使用，按组和/或时间点对样本进行排序。计算每组的平均相对丰度，以可视化处理组之间或处理组内随时间的差异丰度。计算所有样本的Shannon多样性[24]、OTUs和Chao1多样性[25]。比较各组间差异的统计学意义。使用布雷- curtis不相似度[26]、加权UniFrac距离和Unweighted UniFrac距离[27]来确定个体随时间的方差和每组个体之间的平均不相似度。Unweighted UniFrac距离也用于计算主坐标(PCoA)图。测量alpha和beta多样性在时间点之间的变化幅度，并确定治疗组之间和持续时间组之间的显著差异，并用盒图可视化。使用Kruskal-Wallis非参数方差分析和Dunn多重比较检验(GraphPad Prism 7)对大环内酯类药物治疗与非大环内酯类药物治疗患者的平均Chao1多样性进行统计分析(图6)。gydF4y2Ba

alpha多样性随时间的变化(抗生素治疗后样本与每个患者筛查样本的alpha多样性之差)通过为每个alpha多样性度量建立的混合线性模型计算，以alpha多样性变化的幅度为响应变量，以治疗与时间点、性别和年龄之间的相互作用为固定预测变量，以受试者为随机预测变量。然后计算时间点和治疗组合的最小二乘均值。gydF4y2Ba

以β多样性为响应变量，以治疗与时间点、性别和年龄的相互作用为预测变量，以受试者为分层变量，采用排列多元方差分析(perMANOVA)[28]计算β多样性与时间的显著差异，并计算治疗组间的差异。为了确定两两的差异，使用Pillai-Bartlett统计量和错误发现率(FDR) p值调整[29]对模型应用两两的perm.manova。gydF4y2Ba

为了确定VRE定殖患者与非定殖患者之间的alpha多样性是否存在显著差异，首先建立一个广义线性模型(高斯家族，“身份”链接)，以Chao1为响应变量，定殖状态(是否定殖)、性别和年龄为预测变量。然后对模型进行一般线性假设检验，用Tukey多重均值检验[30]确定差异。gydF4y2Ba

分析组gydF4y2Ba

在三个收集点对治疗组、利巴唑酶与安慰剂治疗组进行组间和组内比较。同时还测定了两组间个体相对丰度变化的平均值。比较vre定殖患者与非定殖患者T1样本的相对丰度(Chao1 α多样性)，以及研究期间接受大环内酯治疗患者与未接受大环内酯治疗患者T1和T2样本的相对丰度。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

样品测序和分析gydF4y2Ba

在可能的1236个样本中，共收集了862个样本gydF4y2Ba（gydF4y2Ba在这些收集的样本中，有676个样本进行了DNA提取和测序。对样本进行测序的标准是，必须有一个筛选样本可供研究患者使用，以作为该患者其他样本的基线对照。这些测序样本代表了229个研究对象，其中187个是全三样本集(T0, T1和T2)。其他组包括一个筛选样本和另一个样本(T1或T2)。在这些样本集中，112例来自接受头孢曲松加利巴沙酶治疗的研究对象，117例来自接受头孢曲松加安慰剂治疗的研究对象。在研究期间，共收集了19个样本，并对诊断为CDI的患者进行了测序，46个样本来自非- CDI患者gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba抗生素相关性腹泻(AAD)。此外，从使用大环内酯(包括阿奇霉素、克拉霉素、米德卡霉素或罗红霉素，以及头孢曲松[19])治疗的患者中收集129个样本。T1点收集了81个样本，样本来自筛查阴性，T1点进行VRE定殖的患者。gydF4y2Ba

表1gydF4y2Ba．研究中包括的各种样本类型的数量gydF4y2Ba（gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}为了进行测序，患者必须有一个筛选样本作为他们自己的对照gydF4y2Ba

^bgydF4y2Ba652个样本测序，共5批，24个补充样本来自CDI和AAD患者gydF4y2Ba

^cgydF4y2Ba每个样本分类序列少于25,000个的样本被排除在进一步分析之外gydF4y2Ba

^dgydF4y2Ba112例使用头孢曲松加安慰剂，117例使用头孢曲松加利巴唑酶gydF4y2Ba

^egydF4y2Ba粪便在选择性培养基上的微生物培养结果gydF4y2Ba

^fgydF4y2BaT0样本=6,T1样本=58,T2样本=17gydF4y2Ba

^ggydF4y2BaT1样本=72,T2样本=57，来自采样前接受大环内酯类药物的患者)gydF4y2Ba

类别gydF4y2Ba	数量gydF4y2Ba
总可能的样本gydF4y2Ba	1236gydF4y2Ba
样品收集gydF4y2Ba	862gydF4y2Ba
样品提取和测序gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	676gydF4y2BabgydF4y2Ba
<25,000个分类序列每个样本gydF4y2BacgydF4y2Ba	25gydF4y2Ba
患者代表gydF4y2BadgydF4y2Ba	229gydF4y2Ba
完整的三个样本集gydF4y2Ba	187gydF4y2Ba
与VRE定植相吻合的样本gydF4y2BaegydF4y2Ba	81gydF4y2BafgydF4y2Ba
接受大环内酯类药物治疗的患者的样本gydF4y2Ba	129gydF4y2BaggydF4y2Ba

粪便gydF4y2Ba微生物分析gydF4y2Ba

按处理分配的门属平均相对丰度:gydF4y2Ba拟杆菌门和厚壁菌门是粪便样本中的优势门，尽管在研究中次要门的相对丰度有一些变化，但主要门的相对丰度保持相当稳定(图2A)。然而，在属水平上，两个处理组之间的相对丰度差异更明显(图2B)。例如，相对丰度的增加gydF4y2Ba肠球菌gydF4y2Ba在使用头孢曲松加安慰剂的患者与使用头孢曲松加利巴唑酶的患者的T1样本中观察到。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba各处理组各时间点门(A)和属(B)的平均相对丰度。个别的颜色表示门或属。样本数:T0 PBO=114, RBX=110;T1 PBO = 102, RBX = 105;T2 PBO = 96, RBX = 93。B上的黄色箭头是为了强调gydF4y2Ba肠球菌gydF4y2Ba在T1时，安慰剂组为阳性gydF4y2Ba

多样性的变化gydF4y2Ba

α多样性:gydF4y2BaAlpha多样性的确定使用三个指标，观察到的OTUs, Chao1和Shannon指数。在T0时，两个治疗组之间的alpha多样性在任何指标上没有显著差异(表2)。在T1时，观察到头孢曲松加安慰剂组与头孢曲松加利巴唑酶组的所有三个指标的alpha多样性均有显著损失(表2和图3)。到T2收集点时，安慰剂组的alpha多样性仍明显低于筛查组(表2)。利巴唑酶T2样品的alpha多样性与筛选样品不再有显著差异(表2)，表明微生物群落正在恢复。每个患者的alpha多样性随时间变化的平均幅度(即从T0到T1、从T1到T2和从T0到T2的变化)支持这些发现，在三个时间间隔中，安慰剂治疗的患者比利巴唑酶治疗的患者表现出明显更多的变化(表3)。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Ba各治疗组、安慰剂组(蓝色)和利巴唑酶组(橙色)在各收集点(T0、T1、T2)粪便微生物组的Chao1多样性均值箱线图。中位数用水平线表示，须表示四分位范围的+/- 1.5倍。异常值被标记为单个点。样本组间差异(P值)的显著性如图所示。如果P值没有显示在图上，则采集点之间没有显著差异。样本数:T0 PBO=114, RBX=110;T1 PBO = 102, RBX = 105;T2 PBO = 96, RBX = 93gydF4y2Ba

表2。gydF4y2Ba各种alpha多样性指标、安慰剂与利巴唑酶及收集点的比较(对比P值)(gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}组内样本数量gydF4y2Ba

^bgydF4y2Ba安慰剂在所有三个多样性指标上都低于利巴沙酶gydF4y2Ba

^cgydF4y2Ba对于所有三个多样性指标，T1均低于T0gydF4y2Ba

^dgydF4y2Ba对于所有三个多样性指标，T2均高于T1gydF4y2Ba

^egydF4y2BaT2在所有三个多样性指标上都低于T0)gydF4y2Ba

收集点gydF4y2Ba	对比gydF4y2Ba	辣子鸡gydF4y2Ba	Chao1多样性gydF4y2Ba	香农指数gydF4y2Ba
T0gydF4y2Ba	安慰剂(114)gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba与ribaxamase (110)gydF4y2Ba	0.3728gydF4y2Ba	0.5199gydF4y2Ba	0.8811gydF4y2Ba
T1gydF4y2Ba	安慰剂(102)vs利巴唑酶(105)gydF4y2BabgydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	0.0005gydF4y2Ba
T2gydF4y2Ba	安慰剂(96)vs利巴唑酶(93)gydF4y2BabgydF4y2Ba	0.0014gydF4y2Ba	0.0011gydF4y2Ba	0.0482gydF4y2Ba
治疗组gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T0 (114) vs T1(102)gydF4y2BacgydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba	< 0.0001gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T1 (102) vs T2 (96)gydF4y2BadgydF4y2Ba	0.0001gydF4y2Ba	0.0002gydF4y2Ba	0.0083gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T0 (114) vs. T2 (96)gydF4y2BaegydF4y2Ba	0.0081gydF4y2Ba	0.0015gydF4y2Ba	0.1078gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T0 (110) vs T1 (105)gydF4y2BacgydF4y2Ba	0.0069gydF4y2Ba	0.0104gydF4y2Ba	0.3522gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T1 (105) vs T2 (93)gydF4y2BadgydF4y2Ba	0.0132gydF4y2Ba	0.0252gydF4y2Ba	0.3226gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T0 (110) vs. T2 (93)gydF4y2Ba	0.9969gydF4y2Ba	0.9829gydF4y2Ba	0.9923gydF4y2Ba

表3。gydF4y2Ba不同alpha多样性指标随时间变化的比较，安慰剂与利巴唑酶(对比P值)gydF4y2Ba

（gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}随着时间的变化，安慰剂组与利巴唑酶组相比，从第一个收集点到第二个收集点的减少明显更大)gydF4y2Ba

α多样性指标gydF4y2Ba	T0, T1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	T1到T2gydF4y2Ba	T0到T2gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba
辣子鸡gydF4y2Ba	0.0004gydF4y2Ba	0.1785gydF4y2Ba	0.0550gydF4y2Ba
Chao1多样性gydF4y2Ba	0.0002gydF4y2Ba	0.1678gydF4y2Ba	0.0296gydF4y2Ba
香农指数gydF4y2Ba	0.0027gydF4y2Ba	0.1450gydF4y2Ba	0.1965gydF4y2Ba

β多样性:gydF4y2BaBeta多样性也使用三个指标确定，布雷-柯蒂斯不相似度，加权和非加权UniFrac距离。与alpha多样性数据一致，T0筛选样本的beta多样性在两个治疗组之间没有显著差异(表4)。通过使用un加权UniFrac距离的主坐标分析，与筛选样本相比，安慰剂组T1样本显示出显著的beta多样性损失(P<0.001;图4和表4)。相比之下，与安慰剂组相比，利巴唑酶组T1样本的beta多样性与基线相比没有明显变化(表4)。在T2时，利巴唑酶组似乎已恢复到接近基线(图4)。而安慰剂组仍然处于显著中断状态(表4)。这些un加权UniFrac距离数据得到了安慰剂样本的布雷-柯蒂斯不相似分析的支持，结果显示T0和T1样本、T1和T2样本之间存在类似的显著差异(表4)。加权UniFrac距离分析在安慰剂组或利巴唑酶组的三个收集点均未达到统计学意义(表4)。当计算beta多样性指标随时间变化的平均幅度(即从T0到T1、从T1到T2和从T0到T2的变化)时，通过Bray Curtis不相似度和Unweighted UniFrac距离分析，我们再次观察到安慰剂组与利巴唑酶组的变化幅度有显著差异(表5)。此外，与使用加权UniFrac距离分析时利巴唑酶组的变化相比，安慰剂组从T1到T2的beta多样性有显著变化(表5)。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Ba无加权Unifrac距离的主坐标分析。图描述了两个治疗组(安慰剂和利巴唑酶)在三个收集点(T0(粉色)，T1(绿色)，T2(蓝色)的系统发育分布。添加彩色箭头以强调从T0到T1的变化(多样性丧失，红色箭头)和从T1到T2的变化(恢复，绿色箭头)。星号表示安慰剂组T0到T1、T1到T2的系统发育分布变化与利巴唑酶组比较差异有统计学意义，***，P < 0.01。如果P值不显示，数据集之间没有显著差异。样本数:T0 PBO=114, RBX=110;T1 PBO = 102, RBX = 105;T2 PBO = 96, RBX = 93gydF4y2Ba

表4。gydF4y2Ba各种beta多样性指标、安慰剂与利巴唑酶以及收集点的比较(对比P值)gydF4y2Ba

（gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}组内样本数量gydF4y2Ba

^bgydF4y2BaBray-Curtis和Unweighted UniFrac的安慰剂比利巴唑酶低gydF4y2Ba

^cgydF4y2Ba安慰剂组低于未加权UniFrac组的利巴唑酶gydF4y2Ba

^dgydF4y2Ba对于所有三个多样性指标，T1均低于T0gydF4y2Ba

^egydF4y2BaBray-Curtis和Unweighted UniFrac的T2高于T1gydF4y2Ba

^fgydF4y2BaT2低于未加权UniFrac的T0)gydF4y2Ba

收集点gydF4y2Ba	对比gydF4y2Ba	Bray-CurtisgydF4y2Ba	未加权的UniFracgydF4y2Ba	加权UniFracgydF4y2Ba
T0gydF4y2Ba	安慰剂(114)gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba与ribaxamase (110)gydF4y2Ba	0.8804gydF4y2Ba	0.9257gydF4y2Ba	0.6170gydF4y2Ba
T1gydF4y2Ba	安慰剂(102)vs利巴唑酶(105)gydF4y2BabgydF4y2Ba	0.0180gydF4y2Ba	0.0025gydF4y2Ba	0.4350gydF4y2Ba
T2gydF4y2Ba	安慰剂(96)vs利巴唑酶(93)gydF4y2BacgydF4y2Ba	0.5150gydF4y2Ba	0.0064gydF4y2Ba	0.4690gydF4y2Ba
治疗组gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T0 (114) vs T1 (102)gydF4y2BadgydF4y2Ba	0.0037gydF4y2Ba	0.0025gydF4y2Ba	0.0800gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T1 (102) vs T2 (96)gydF4y2BaegydF4y2Ba	0.0037gydF4y2Ba	0.0025gydF4y2Ba	0.1420gydF4y2Ba
安慰剂gydF4y2Ba	T0 (114) vs. T2 (96)gydF4y2BafgydF4y2Ba	0.8804gydF4y2Ba	0.0319gydF4y2Ba	0.5460gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T0 (110) vs T1 (105)gydF4y2Ba	0.7575gydF4y2Ba	0.0614gydF4y2Ba	0.5540gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T1 (105) vs T2 (93)gydF4y2Ba	0.9950gydF4y2Ba	0.1713gydF4y2Ba	0.5540gydF4y2Ba
RibaxamasegydF4y2Ba	T0 (110) vs. T2 (93)gydF4y2Ba	0.9950gydF4y2Ba	0.9920gydF4y2Ba	0.971gydF4y2Ba

表5gydF4y2Ba．不同beta多样性指标随时间变化的比较，安慰剂与利巴唑酶(对比P值)gydF4y2Ba

（gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}随着时间的变化，安慰剂与利巴唑酶从第一个收集点到第二个收集点的度量值显著更大的降低gydF4y2Ba

^bgydF4y2Ba随着时间的变化，安慰剂与利巴唑酶从第一个收集点到第二个收集点的度量值显著增加)gydF4y2Ba

β多样性指标gydF4y2Ba	T0, T1gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba	T1到T2gydF4y2BabgydF4y2Ba	T0到T2gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba
Bray-CurtisgydF4y2Ba	0.0059gydF4y2Ba	0.0033gydF4y2Ba	0.0418gydF4y2Ba
未加权的UniFracgydF4y2Ba	0.0001gydF4y2Ba	0.0003gydF4y2Ba	0.0003gydF4y2Ba
加权UniFracgydF4y2Ba	0.1356gydF4y2Ba	0.0119gydF4y2Ba	0.1321gydF4y2Ba

VRE殖民:gydF4y2Ba在2b期研究中，与利巴沙酶患者(69个安慰剂和36个利巴沙酶，P=0.0001, 71个安慰剂和40个利巴沙酶，P=0.0002)相比，大量安慰剂患者出现了新的VRE定殖，其微生物学检测结果为阴性，随后在T1和T2两个采集点的一个或两个采集点均为阳性)[19]。用Chao1度量法测量，从vre定殖的患者收集的粪便样本与未定殖的患者样本相比，平均α多样性显著降低(P<0.001;图5)。gydF4y2Ba

图5。gydF4y2Ba由VRE殖民化状态绘制的Chao1多样性(VRE殖民化，粉红色;非殖民化，蓝色)在第二个时间点(T1)。这个盒子横跨第一和第三四分位数。中位数用水平线表示，须表示四分位范围的+/- 1.5倍。* * * P < 0.001。样本数量:VRE拓殖=55，非拓殖=152gydF4y2Ba

单一支配被定义为≥30%的由单一属组成的肠道微生物组组成，并被认为对患者健康产生负面影响[31]。对患者微生物群中肠球菌相对丰度的分析显示，15例接受安慰剂治疗的患者肠球菌占主导地位，而接受利巴唑酶治疗的患者只有4例(P=0.004)。与这一观察结果一致的是，这些肠球菌为主的安慰剂患者中有6例和利巴唑酶为主的患者中只有1例也通过微生物学方法确定了VRE定植。gydF4y2Ba

大环内酯物使用:gydF4y2Ba在2b期研究过程中，治疗医师可酌情使用大环内酯类药物来加强头孢曲松对LRTI的治疗。在T2收集点[19]之前，利巴沙酶组共有76例患者和安慰剂组共有72例患者在头孢曲松的基础上服用大环内酯类药物。从这些患者中，T1和T2分别收集了72和57份粪便样本。对每个收集点的平均α多样性(如图6所示的Chao1为例)的分析显示，与未接受大环内酯的患者相比，在头孢曲松治疗中添加大环内酯会导致T1和T2的α多样性进一步降低。与安慰剂组相比，头孢曲松加利巴唑酶大环内酯组患者的这种降低更明显。gydF4y2Ba

图6。gydF4y2Ba大环内酯治疗与非大环内酯治疗患者的平均Chao1多样性。每个采集点的平均Chao1指数显示:安慰剂(蓝色)vs利巴唑酶(橙色)，大环内酯治疗(虚线)vs非大环内酯治疗(实线)。错误条表示标准错误。插图:大环内酯类药物治疗的患者(虚线)与非大环内酯类药物治疗的患者(实线)所有样本的Chao1平均值。显著性差异用星号表示:* P=0.1， ** P<0.05， *** P=0.0001， **** P<0.0001。样本数:T0 PBO=82, PBO+大环内酯=33,RBX=75, RBX+大环内酯=36;T1 PBO=74, PBO+大环内酯=36,RBX=80, RBX+大环内酯36;T2 PBO=76, PBO+大环内酯=25,RBX=66, RBX+大环内酯=32。样本插入数:TO不含大环内酯=157，大环内酯=69;T1无大环内酯=154，大环内酯=72; T2 no macrolide=142, macrolide=57

不同研究终点的多样性比较:CDI和AADgydF4y2Ba2b期研究的主要终点是当地临床实验室[19]诊断的CDI的发展。CDI定义为腹泻和检测gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba腹泻粪便样本中的毒素(或其基因)。如果一个腹泻样本的毒素是阴性的，那么它被定义为非gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba抗生素相关性腹泻(AAD)。根据这些标准，9例患者被诊断为CDI(7例为安慰剂，2例为利巴唑酶)，而23例患者符合非CDI标准gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2BaAAD(12安慰剂和11利巴唑酶)[19]。从这些患者中，分别收集了19和46个粪便样本。所有CDI样本与所有非CDI样本的平均alpha多样性的比较表明，所有三个指标都有显著差异gydF4y2Ba（gydF4y2Ba表6gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba而AAD与非AAD样本仅在Chao1多样性上存在显著差异，其余两项差异不显著(表6)gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba在接受利巴沙酶治疗的CDI患者与接受安慰剂治疗的CDI患者之间，没有观察到任何α多样性指标的显著差异，CDI与AAD患者之间也没有观察到显著差异(表6)。gydF4y2Ba

通过调整年龄、性别和患者分层来获得beta多样性指标，以比较治疗组和样本采集点。在加权UniFrac和非加权UniFrac的CDI和AAD样本之间，在布雷- curtis不相似度和非加权UniFrac的CDI和非CDI样本之间，以及在所有三个指标的AAD和非AAD样本之间观察到beta多样性的显著差异(表6)。gydF4y2Ba

表6所示。gydF4y2Ba各研究终点alpha和beta多样性指标的比较(gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}Alpha多样性指标被用作三个线性混合模型的响应变量。每个模型的预测变量包括研究结果、性别和年龄。以患者ID作为分层变量，计算每个模型的最小二乘均值，gydF4y2Ba^bgydF4y2Ba数量的样本,gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba包括广告样本,gydF4y2Ba^dgydF4y2Ba包括CDI样品gydF4y2Ba

^egydF4y2BaBeta多样性指标被用作三个线性混合效应模型的响应变量。每个模型的预测变量包括研究结果、性别和年龄，以患者ID作为分层变量，检验研究结果收集点与治疗组之间的相互作用。每个模型使用perMANOVA)gydF4y2Ba

α多样性gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba		估计gydF4y2Ba	标准错误gydF4y2Ba	度自由gydF4y2Ba	t比gydF4y2Ba	P值gydF4y2Ba
CDI (19)gydF4y2BabgydF4y2Ba与non-CDI (589)gydF4y2BacgydF4y2Ba
Chao1gydF4y2Ba		-568.2gydF4y2Ba	211.0gydF4y2Ba	291.7gydF4y2Ba	-2.693gydF4y2Ba	0.0075gydF4y2Ba
观察到的辣子鸡gydF4y2Ba		-370.8gydF4y2Ba	148.6gydF4y2Ba	294.3gydF4y2Ba	-2.496gydF4y2Ba	0.0131gydF4y2Ba
香农指数gydF4y2Ba		-0.675gydF4y2Ba	0.269gydF4y2Ba	303.0gydF4y2Ba	-2.509gydF4y2Ba	0.0126gydF4y2Ba
AAD (46) vs.非AAD (543)gydF4y2BadgydF4y2Ba
Chao1gydF4y2Ba		-328.1gydF4y2Ba	138.9gydF4y2Ba	273.6gydF4y2Ba	-2.362gydF4y2Ba	0.0189gydF4y2Ba
观察到的辣子鸡gydF4y2Ba		-190.3gydF4y2Ba	97.9gydF4y2Ba	274.8gydF4y2Ba	-1.944gydF4y2Ba	0.0529gydF4y2Ba
香农指数gydF4y2Ba		-0.159gydF4y2Ba	0.177gydF4y2Ba	275.5gydF4y2Ba	-0.899gydF4y2Ba	0.3693gydF4y2Ba
β多样性gydF4y2BaegydF4y2Ba	DfgydF4y2Ba	平方和gydF4y2Ba	意思是广场gydF4y2Ba	f模型gydF4y2Ba	R2gydF4y2Ba	公关(F >)gydF4y2Ba
CDI (19) vs AAD (46)gydF4y2Ba
Bray-CurtisgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.5503gydF4y2Ba	0.55033gydF4y2Ba	1.24644gydF4y2Ba	0.02187gydF4y2Ba	0.051gydF4y2Ba
未加权的UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.3268gydF4y2Ba	0.32685gydF4y2Ba	1.10814gydF4y2Ba	0.01943gydF4y2Ba	0.023gydF4y2Ba
加权UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.1676gydF4y2Ba	0.16755gydF4y2Ba	1.13084gydF4y2Ba	0.01434gydF4y2Ba	0.046gydF4y2Ba
CDI (19) vs.非CDI (589)gydF4y2Ba
Bray-CurtisgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.712gydF4y2Ba	0.71221gydF4y2Ba	1.62617gydF4y2Ba	0.00249gydF4y2Ba	0.001gydF4y2Ba
未加权的UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.520gydF4y2Ba	0.52046gydF4y2Ba	1.8799gydF4y2Ba	0.00284gydF4y2Ba	0.001gydF4y2Ba
加权UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.177gydF4y2Ba	0.17671gydF4y2Ba	1.0194gydF4y2Ba	0.00154gydF4y2Ba	0.103gydF4y2Ba
AAD (46) vs.非AAD (543)gydF4y2Ba
Bray-CurtisgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.866gydF4y2Ba	0.86616gydF4y2Ba	1.97947gydF4y2Ba	0.00302gydF4y2Ba	0.001gydF4y2Ba
未加权的UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.688gydF4y2Ba	0.68802gydF4y2Ba	2.4854gydF4y2Ba	0.00375gydF4y2Ba	0.001gydF4y2Ba
加权UniFracgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0.66gydF4y2Ba	0.66031gydF4y2Ba	3.8205gydF4y2Ba	0.00576gydF4y2Ba	0.013gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

利巴唑酶被设计用来保护肠道微生物群免受过量β-内酰胺类抗生素的影响，这些抗生素在静脉给药[15]后被排泄到胃肠道。一项2b期研究证实了利巴沙酶的潜在临床疗效，在头孢曲松治疗LRTI的基础上加入利巴沙酶显著降低了CDI[19]的发生率。CDI与抗生素的使用密切相关，抗生素扰乱了肠道微生物组的平衡，从而降低了完整微生物组[1]提供的定殖耐药性。目前对2b期研究中收集的粪便样本的后续分析结果与头孢曲松加利巴沙酶治疗的患者与头孢曲松加安慰剂治疗的患者相比，利巴沙酶可以减少肠道微生物组的破坏。这一结论得到了对三个采集点α和β多样性的静态分析(图3和4、表2和4)以及患者内部α和β多样性在采集点之间的变化(表3和5)的支持。尽管在T1采集点与T0相比，利巴唑酶组在T1采集点有一定的多样性损失，在T2时，利巴唑酶组的多样性似乎恢复到接近基线水平，而安慰剂组仍然明显中断(表2)。gydF4y2Ba

加权Unifrac距离组与非加权Unifrac距离组和布雷-柯蒂斯差异组在beta多样性方面的差异较小。加权Unifrac距离是一种不相似距离度量，它使用样本中OTU的系统发育分布以及OTU的相对丰度来度量两个样本之间的距离，而un加权Unifrac距离也度量样本中OTU的系统发育分布，但只依赖于存在/缺失数据，而不是丰度数据[27]。不考虑相对丰度的定性测量，如Unweighted UniFrac，经常被用于检测群落中的永久性变化，如抗生素破坏微生物组引起的变化，而更多的定量测量，如Weighted UniFrac，揭示了更短暂的因素的影响，如营养变化[32]。这些多样性指标的不同应用可能有助于解释本研究中这些分析结果的差异。gydF4y2Ba

2b期利巴唑酶研究旨在招募CDI高风险患者。患者年龄较大(实际平均年龄为70岁)，预计住院并接受≥5天的头孢曲松治疗(实际中位数为8天，平均住院天数在美国/加拿大为6天，在塞尔维亚为13天)，病情较重(肺炎指数评分[33]为90-130)[19]。因此，与更年轻、更健康的人群[34]相比，这一患者组的肠道微生物组的基线健康水平预计已经降低。当肠道菌群的α多样性达到研究终点的患者的CDI和非gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba将AAD与其他患者进行比较，这些终点人群显示出微生物菌群α多样性的显著减少(表6)。因此，尽管研究人群与一般人群相比，在基线肠道微生物菌群多样性方面可能更不适合，但那些发生了CDI和AAD的患者的肠道微生物菌群进一步退化，这与疾病进展相一致。gydF4y2Ba

肠道微生物组分析的一个潜在好处是开发指标，使临床医生能够预测患者发生严重并发症(如CDI)的风险增加[35,36]。虽然在研究过程中，从端点人群中获得的样本数量有限，但有趣的是，CDI和非CDI样本之间的所有三个alpha多样性指标都有显著差异，但两个治疗组之间的CDI患者之间的alpha多样性没有显著差异。这可能表明在研究期间被诊断为CDI的患者可能已经达到了某种最小的alpha多样性阈值，超过这个阈值他们就不再能够抵抗定植和生长gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba．AAD患者与非AAD患者之间的差异较小，提示AAD患者的肠道微生物菌群破坏可能比CDI患者更少，尽管CDI和AAD患者之间的微生物菌群多样性差异不显著。然而，β多样性指标的比较显示，在分析中考虑收集点和治疗组时，CDI和非CDI以及AAD和非AAD患者之间存在显著差异。总的来说，这些数据表明微生物组多样性的某种最小阈值可能存在，可以预测风险。本研究的一个局限性是从终点人群中获得的可供比较的患者样本很少，因此，需要对来自不同人群的大量样本进行分析，以开发和验证任何微生物组指数。gydF4y2Ba

肠道微生物群的破坏会导致机会性病原体的定植gydF4y2Ba梭状芽孢杆菌gydF4y2Ba和其他生物[1,2,37]。肠球菌因在微生物组紊乱后定植肠道而臭名昭著[38-40]，并与CDI的发生密切相关[38,39]。通常，这些肠球菌对万古霉素具有耐药性，与VRE定殖是肠球菌菌血症发生的一个重要危险因素[41-43]。2b期研究显示，与利巴沙酶相比，更多的安慰剂患者被VRE[19]新定植，在该分析中，VRE定植与微生物组多样性损失之间的相关性得到了证实(图5)。突变菌组的改变通常也会导致单一属的优势gydF4y2Ba肠球菌(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］gydF4y2Ba．共发现19例肠道菌群中肠球菌占比≥30%的患者，安慰剂组15例，利巴沙酶组4例，然而，在研究和随访期间未观察到系统性肠球菌感染。这些结果进一步支持利巴沙酶限制了头孢曲松治疗患者肠道微生物群的破坏。gydF4y2Ba

在2b期利巴沙酶研究期间，治疗医师可以选择在处方的头孢曲松基础上加入大环内酯治疗。与单独使用头孢曲松相比，添加大环内酯似乎加剧了α多样性的丧失(图6，内嵌)。每个治疗组的比较显示，与安慰剂组相比，同时接受大环内酯类药物的利巴唑酶患者多样性下降更大gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图6)。这种更明显的效果可能是由于接受利巴唑酶治疗的患者保留了较少紊乱的微生物群，因此在接触大环内酯时失去了更多的多样性。在研究期间发生CDI的9名患者中，6名(5名安慰剂和1名利巴唑酶)除头孢曲松外还服用了大环内酯类药物。由于CDI的风险与所使用抗生素的种类数量有关[6,10]，这些数据与大环内酯引起额外的微生物组损伤从而增加CDI的风险一致。虽然各治疗组接受大环内酯类药物治疗的患者数量相似，但利巴唑酶组发生CDI的患者明显较少(风险降低2.4%，95% CI -0.6至5.9;片面的p = 0.045)[19]。这些数据支持这样一个概念，即减少肠道中过量的头孢菌素可以降低CDI的风险，即使同时使用其他抗生素，如大环内酯类抗生素。gydF4y2Ba

虽然抗生素对于治疗严重的细菌感染是必不可少的，但它们可能会产生意想不到的后果，即破坏肠道微生物群。这种破坏不仅增加了机会性感染(如CDI)的风险，而且还可能对健康产生其他有害的、持久的影响[17]。口服利巴唑酶的方法利用了一种天然的防御剂，细菌通常使用β-内酰胺酶来保护自己免受抗生素的伤害，而不是保护肠道菌群免受β-内酰胺的附带伤害。除了2b期研究[19]的结果外，本文提供的数据证明了这种新的预防策略的效用，并支持继续开发利巴唑酶作为静脉注射β-内酰胺患者的肠道微生物组保护剂。利巴沙酶可能特别有利于需要长时间静脉注射β-内酰胺治疗的患者，如造血细胞移植人群，他们有发生不定感染和其他并发症的高风险，包括由抗生素介导的微生物组损伤[44]引起的急性移植物抗宿主病。gydF4y2Ba

资金信息gydF4y2Ba

2b期利巴唑酶研究和后续样本分析由Synthetic Biologics, Inc.资助。gydF4y2Ba

伦理批准和患者同意参与gydF4y2Ba

2b期利巴唑酶研究方案和知情同意书获得了相应的机构审查委员会或伦理委员会的批准，所有研究患者都提供了书面同意参与研究并对其粪便样本进行分析。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

JK-K和SC是或曾经是合成生物公司(Synthetic Biologics, Inc.)的员工，该公司正在为商业用途开发利巴唑酶。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

感谢陈雄乐对手稿的审阅，感谢Evan Byers、Denise Lynch和DNA基因技术公司团队的出色技术支持。我们也要感谢2b期利巴沙酶研究的研究人员和研究协调员，感谢他们勤奋地收集用于本次分析的粪便样本，以及患者提供的样本。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

JK-K构思并设计了这项研究，分析了数据并撰写了手稿。SC分析了数据并审阅了手稿。两位作者都阅读并认可了最终稿。gydF4y2Ba

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