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摘要

锌是哺乳动物体内的一种微量元素，越来越多的证据表明，锌在骨发育和骨细胞(如成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞)的分化中发挥着关键作用。体内和体外研究表明，锌影响破骨细胞的分化。锌敏感离子通道已有报道。与锌相关的离子通道是ORAI1，它是一个存储运营的Ca^2＋锌抑制了该通道的活性。ORAI1通道在调节破骨细胞钙中起重要作用^2＋破骨细胞分化过程中的振荡。下调ORAI1抑制破骨细胞分化。锌也能抑制破骨细胞的形成，但ORAI1基因的敲除降低了锌的抑制作用。有趣的是，锌可以改变破骨膜电位。基于此，我们对超极化激活的环核苷酸调节(HCN)通道进行了研究，发现该通道在破骨细胞中高表达。高浓度氯化锌增加了HCN通道产生的Ih电流，表明HCN通道与锌之间存在复杂的关系。锌通过锌调节离子通道在骨生理中发挥多种作用。这些离子通道的信号转导将成为治疗骨骼疾病的有效靶点。

介绍

骨是钙的主要储存介质^2＋)和锌[1]。尽管Ca^2＋骨生物学中相关信号转导的研究已经深入[2-4]，细胞内锌信号转导及其相关分子的生物学特性尚不清楚。锌是包括骨重塑在内的生理代谢过程中必不可少的微量元素[5,6]。大量研究表明，缺锌会导致骨质流失，增加骨折的风险[7-11]。最近，一些报道表明锌转运体在骨和软骨发育[5]和骨关节炎[12]的病理中起着重要作用。

破骨细胞的分化机制及相关的细胞内信号通路已被大量研究[3,4,13,14]。核因子受体激活因子-κB (RANK)/RANK配体(RANKL)信号通路诱导细胞内Ca的变化^2＋水平([Ca^2＋］_我）;这些变化导致Ca^2＋-钙调磷酸酶依赖的脱磷酸化和活化活化t细胞胞浆核因子1 (NFATc1)，它从胞质[4]易位到细胞核。在培养基中添加锌可通过降低[Ca^2＋］_我NFATc1易位后[15]。此外，锌相关分子如离子通道和转运体也在破骨细胞分化中发挥重要作用[14-17]。最近的一项研究表明，内质网定位的l型电压门控钙^2＋胞内锌信号[18]通路是由细胞膜去极化激活的。此外，我们之前的研究表明，锌影响破骨细胞膜电位和超极化激活的环核苷酸调节通道(HCN)[14]。

本研究主要探讨锌对破骨细胞的作用，以及锌调节的离子通道在破骨细胞分化中的作用。本文介绍了细胞内锌信号的最新进展，包括破骨细胞中锌相关离子通道、ORAI1和hcn。由于锌对各种离子通道的活性有抑制作用，本文叙述了锌与骨生理中离子通道的关系。

材料和方法

细胞培养

RAW 264.7小鼠破骨细胞前体样细胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)在添加10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMEM (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan)中培养。所有细胞保持在37ºC和5% CO₂在潮湿的空气中。除非另有说明，所有化学品均购自日本大阪Wako Pure Chemical Industries公司。为了分化破骨细胞，我们将RAW 264.7细胞接种于2.0×10⁵细胞/厘米²加入可溶性RANKL (sRANKL, 50 ng/mL;东方酵母，东京，日本)。TRAP染色如前所述[3,14]。Orai1-siRNA和control-siRNA购自日本横滨Thermo Fisher Scientific K.K.公司。根据制造商协议，使用RNAi-MAX (Thermo Fisher Scientific K.K.)将siRNA转染到RAW细胞中。trap阳性细胞超过3个细胞核则被定义为多核破骨细胞。

基因表达分析

基因表达检测如前所述[3,14]。根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒(Qiagen K. K.， Tokyo, Japan)提取总RNA。用高容量cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)从总RNA合成第一链cDNA。每个合成反应的总RNA量为1 μg。实时定量PCR (qRT-PCR)采用step1实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)、SYBR Green (Fast SYBR Green master mix, Thermo Fisher Scientific)和特异性正、反引物进行。转录水平相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)．

电生理学

如前所述，添加RANKL后，对raw来源的破骨细胞培养3-5天进行电生理记录[14,19]。对于整个细胞的记录，标准的外部溶液包含145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂， 1毫米氯化镁₂， 10 mM葡萄糖，10 mM HEPES (pH 7.3)，或10 mM 2-吗啡酰亚胺乙烷磺酸(MES) (pH 5.5)， 0.1%牛血清白蛋白。研究高浓度锌，1mM氯化锌的影响₂被放到了浴缸里。移液管溶液含有130mm k -葡萄糖酸盐，20mm KCl, 3mm MgCl₂， 1 mM EGTA, 1 mM ATP, 0.5 mM GTP, 10 mM HEPES (pH 7.3)。通过添加氢氧化钠和KOH调整浴液和吸管溶液的pH。渗透压维持在280 ~ 300 mOsm之间。

硼硅玻璃移液管的电阻为5-8 MΩ。参考电极为Ag-AgCl导线，通过林格琼脂桥连接到浴液。千兆密封形成前的零电势为0 mV。电流信号用Axopatch 200A放大器(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)记录，用Digidata 1200模数转换器(Axon Instruments)在1-2 kHz进行数字化，并使用pCLAMP软件(Axon Instruments)进行分析。保持电位为- 30mv时每10- 30s施加电压步长(从-30到- 150mv)。

结果与讨论

破骨细胞中的锌和ORAI1

对锌有选择性的离子通道尚未被鉴定出来。然而，锌调节各种离子通道的活性[20-22]。其中一个通道，电压门控H⁺通道(H⁺通道)，在破骨细胞中高表达，并参与调节细胞内pH[19,23]。锌抑制氢产生的质子电流⁺提示锌影响破骨细胞内ph⁺据报道，raw264.7衍生的破骨细胞中的通道被细胞外磷酸盐激活，并被认为支持活性氧(ROS)的产生，ROS是RANK-RANKL信号级联[24]的重要中介。通过抑制H+通道降低ROS产物，可能下调破骨细胞的形成。

另一个与锌有关的离子通道是ORAI1 Ca^2＋渠道，它是一个存储操作的Ca^2＋入口(SOCE)通道子单元(25)。ORAI1 Ca^2＋钙通道在破骨细胞钙的维持中起重要作用^2＋破骨细胞分化过程中的振荡[16]。下调ORAI1可抑制破骨细胞的形成，减少NFATc1的核易位。需要注意的是，锌可以抑制SOCE通道的活性，降低钙的含量^2＋进入细胞[26-28]。基于这些报道，我们研究了在RAW 264.7细胞破骨细胞分化过程中，锌与ORAI1的关系。与对照- sirna转染相比，ORAI1- sirna转染显著降低了ORAI1 mRNA的表达(图1a)。锌抑制了对照鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性;然而，在orai1 -敲低细胞中观察到TRAP活性降低较少(图1b)。这一结果表明，锌对破骨细胞形成的抑制作用部分包括抑制ORAI1活性。

图1所示。ORAI1的敲除降低了锌对RAW264.7细胞破骨形成的抑制作用。（答:siRNA转染抑制OARI1，转染control-siRNA或ORAI1-siRNA后24 h ORAI1 mRNA表达降低(Mean±SD, n=5， *p<0.01)。b:添加RANKL (50 ng/ml)后3天，对照组和orai1 -敲除(ORAI1-KD)细胞在氯化锌(100 μM)存在或不存在时的TRAP活性(n=8)。* P < 0.01。锌抑制破骨细胞的形成(1^圣与2^nd左起列);而ORAI1基因敲低则降低了其抑制作用(3^{理查德·道金斯}与4^th列)

最近，我们发现锌能使破骨细胞细胞膜电位短暂超极化(14)，尽管这种改变细胞膜电位的机制尚不清楚。这一发现表明锌通过电压门控离子通道调节细胞功能。基于我们的研究结果，我们将重点放在hnc上，它在可兴奋细胞中具有重要的功能[29-32]。HCNs是非选择性阳离子通道，控制心肌细胞的节律性活动和神经元放电的时间，被称为“起搏器通道”[32,33]。由于HCN1-4的全部四个亚基已被克隆，HCN1-4在心脏和大脑中的生理作用已被研究。其中一个亚基HCN1大量分布于小脑、海马和皮层，被认为参与学习和记忆[32,34]。HCNs通过产生特定的超极化激活电流(称为Ih或If)来发挥其作用，这在20世纪70年代被发现[35]。Ih在决定这些可兴奋细胞的静息膜电位方面起着重要作用[33,36]。

ZD7288 (HCN抑制剂[14])可降低锌诱导的破骨细胞细胞膜电位超极化。HCN1和HCN4均在破骨细胞中表达:根据qRT-PCR分析和全细胞膜片钳Ih电流记录，主要亚型为HCN4。为了确认HCN4与锌之间的关系，我们用siRNA敲除HCN4。锌对破骨细胞形成的抑制减弱。研究膜电位对破骨细胞分化的影响是具有挑战性的，因为需要非侵袭性方法来调节膜电位。为了解决这个问题，我们生成了表达光驱动泵(Arch)的RAW细胞系。该拱门被黄绿色光激活，并通过质子传输[37]进行超极化。使用这种光控系统，超极化被证明可以促进破骨细胞的形成。因此，锌通过细胞内信号级联抑制破骨细胞分化，而通过锌诱导的超极化促进破骨细胞分化。在生理条件下，HCN功能抑制了锌诱导的破骨细胞生成(通过改变膜电位)(图2)。这些结果表明，锌通过改变膜电位影响电压门控离子通道的活性。

图2。HCN和锌在破骨细胞发生中的关系

除此之外，我们还发现高浓度氯化锌增加了Ih电流(图3a)，表明HCN通道与锌之间存在复杂的关系。Ih电流的增加意味着HCN通道活动的加速;因此，高浓度的锌本身就可以减少超极化诱导的破骨细胞生成。虽然高锌浓度对骨生理的影响机制尚不清楚，但骨吸收过程中吸收陷窝可能暴露于高浓度的锌(图3b)。高浓度锌对破骨细胞的影响将在我们后续涉及HCN通道的实验中进行研究。

图3。高浓度锌对Ih电流的影响(答:在加入氯化锌之前和之后，保持电位为-30 mV时，超极化脉冲(-150 mV)诱发的典型全细胞电流₂(100μM)。ZnCl₂原始OC中超极化激活的内向电流增加。b:高浓度锌的生理条件。ν:核)

结论

骨骼中富含锌;然而，其在骨生物学中的生理作用尚不清楚。锌通过锌转运体直接影响破骨细胞的功能。由于锌可以抑制某些类型的离子通道并引起膜电位的变化，了解锌调节离子通道的功能将会在骨生物学中带来新的发现。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

参考文献

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