背景:Angelman综合征(AS)是一种神经发育障碍,其特征为严重智力低下、言语缺失、面部特征畸形、小头畸形、癫痫发作、脑电图(EEG)异常和神经问题。
四种已知的分子机制导致母性缺陷UBE3A(1)母体染色体15q11.2-q13上AS关键区域缺失(70%),(2)父系单亲本二体(pUPD)(2-7%),(3)印迹缺陷(3 - 5%),(4)母体拷贝突变UBE3A(10%).
材料和方法:在这里,我们报道了11例突尼斯AS患者的临床特征、行为、脑电图表现,并通过FISH技术的分子分析、微卫星研究和甲基化特异性多重连接依赖探针扩增(MS-MLPA)证实。
结果:通过使用荧光原位杂交(FISH)技术在10名患者中检测到15号染色体上的关键AS区域缺失,并通过甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增(MS-MLPA)确认这些患者(7名男性,4名女性)的诊断.一项微卫星分析仅检测到一名单亲二体患者。
结论MS-MLPA检测缺失和甲基化异常被认为是确诊Angelman综合征的一种快速、经济的方法,有助于早期介入治疗,并应提供遗传咨询。
Angelman综合征,甲基化障碍,15q11-q13位点,父系单亲本
缩写
AS:Angelman综合征;FISH:荧光原位杂交;UPD:单亲二体;MS-MLPA:甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增;EEG:脑电图;PWS:Prader-Willi综合征;MRI:磁共振成像;IC:印迹中心
Angelman综合征(AS)(MIM#105830)是一种影响儿童的神经遗传疾病,1965年由英国医生Harry Angelman首次发现,并由此得名[1]。它是由基因组印记形式的非孟德尔遗传引起的最常见的遗传综合征之一。据估计,AS的发病率在1/10000到1/20000之间,男性和女性的发病率相同[2,3]。世界各地都报告了没有种族偏好的病例。
AS可归因于15q11-q13[4]染色体区域内基因表达的缺失。这种表型在婴儿期和成年期是众所周知的,但临床特征可能随着年龄而改变。主要临床特征为严重智力迟钝、癫痫发作和脑电图异常、神经系统问题和明显的面部畸形。行为问题如多动症和睡眠问题也有报道,尽管这些患者大多表现出快乐的性格,并有不恰当的笑声。自然史是典型的正常生长参数在早期的几个月。2岁出现发育性小头畸形,6-12个月出现技能习得延迟,3岁出现语言障碍和癫痫,80%的病例出现共济失调步态异常。枕骨沟、枕骨平、舌突出、口宽、齿间距宽、斜视、前突等畸形表型约占80%。神经肌肉表现包括舌突、咀嚼/咀嚼行为、吞咽/吮吸障碍、婴儿期躯干肌张力减退、下肢深腱反射亢进、行走时上抬、屈曲上肢,以及踝内旋或外翻定位的宽基础步态[5]。异常的睡眠-觉醒周期,热不耐受,异常的食物相关行为也可以看到[5]。脑电图通常比临床预期的更异常,但在基因证明为AS[1]的个体中也可能是正常的。
Angelman综合征主要是由于母体拷贝基因表达,缺乏泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)在胎儿脑和成人额叶皮层。这可能是由于母体15q11-13位点的缺失(68%),突变UBE3A基因(11%)、父系单亲二体(UPD)(7%)和印迹中心(IC)异常(3%)[6]。然而,10%的AS患者有非诊断性分子发现[5]。
有很多技术可以确诊阿斯伯格综合症。据报道,在大约80%的AS[5]患者中,在AS关键区域发现异常的父母特异性甲基化。更常用的甲基化评估技术包括甲基化特异性多重连接依赖探针扩增(MS-MLPA)和Southern blot分析。由于需要大量的高分子量DNA以及所需的时间和技术承诺,后者已经大大减少了。MS-MLPA能够确定异常甲基化状态和/或SNRPN位点的缺失。在SNRPN位点的异常甲基化但正常的二倍体补体的情况下,单倍型研究被用于区分UPD和印迹缺陷,特别是印迹中心的缺陷。
本研究的目的是评估MS-MLPA分析在11名突尼斯患者队列中的表现,这些患者经荧光原位杂交(FISH)或单倍型研究确诊为AS;以评估一致性以及这些实验室技术的优缺点。
病人
11年(2006年和2017年)期间,11名AS疑似患者(7名男性和4名女性)被转至Farhat hach大学医院的人类细胞遗传学、分子遗传学和生殖生物学实验室。
患者表现为严重的智力迟钝、语言障碍、癫痫发作或脑电图异常和面部畸形(表1)。
表1.突尼斯11例AS患者的临床和遗传特征
情况下 n° |
性别 |
诊断年龄(年) |
头围 |
诊断时重量(Kg) |
无支撑坐 |
走 |
演讲 (单字) |
鱼/ MS-MLPA结果 |
1. |
M |
7. |
47厘米 (4 sd) |
23 |
3 Y |
4 y |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
2. |
M |
2.6 |
49厘米 |
14 |
1 y |
不稳定的 |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
3. |
M |
5. |
47厘米 (2 SD) |
15 |
18个月 |
不稳定的 |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
4. |
M |
1.8 |
47厘米 |
9 |
没有 |
没有 |
4.5 Y |
15 q11。问题删除 |
5. |
F |
6. |
46厘米 (2 SD) |
20. |
1 y 2个月 |
5 y |
4.5 Y |
15 q11。问题删除 |
6. |
M |
6. |
50.5厘米(+0.6标准差) |
23 |
4 y |
没有 |
2岁 |
15 q11。问题删除 |
7. |
F |
2.8 |
45厘米 (-3.38标准差) |
12 |
没有 |
没有 |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
8. |
F |
3. |
46厘米 (3 SD) |
13 |
6个月 |
没有 |
没有一个 |
乌利希期刊指南 |
9 |
M |
3. |
47.5厘米 (2 SD) |
15 |
7个月 |
没有 |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
10 |
F |
3. |
47厘米 |
14 |
1年 |
3 y |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
11 |
M |
2. |
46厘米 |
13.5 |
1 y |
没有 |
没有一个 |
15 q11。问题删除 |
M、 男性;F,女性;Y:年;SD:标准偏差;FISH:荧光原位杂交;MS-MLPA:甲基化特异性多重连接依赖性探针扩增。
有4个家庭有血缘关系。来自突尼斯不同地区的7个不相关家庭的患者也接受了调查。血亲家庭是没有血缘关系的,来自全国不同地区。
这项研究得到了当地伦理委员会的批准,并在患者及其家属知情同意的情况下进行。
常规细胞遗传学分析
根据患者及其父母的标准程序进行染色体分析。简单地说,外周血淋巴细胞在RPMI1640培养基(Gibco)中培养®(美国纽约州格兰德岛),富含20%胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素(青霉素和链霉素)和植物血凝素。细胞在37°C培养箱中培养72小时,其中含有5%的CO2..停用秋水仙碱溶液(0.05 μg/mL)培养45分钟。收获后,细胞暴露于低渗透溶液(0.075 mol/L KCl)中,用甲醇/醋酸(3:1)固定。玻片制作,r带染色。使用Applied imaging CytoVision核型分析系统对每个样本进行至少20个中期分析®.核型根据国际人类细胞遗传学命名系统(ISCN)2005[6,7]的建议进行分配。
荧光原位杂交(FISH)
探针D15Z1/SNRPN/PML的荧光原位杂交(FISH)分析®根据供应商协议进行治疗。在所有的病例中,我们研究了至少10个中期细胞核和50个间期细胞核,在这些细胞核中,我们清楚地识别出了与对照探针杂交;D15Z1位于中心体区(光谱绿色),PML位于15q22-24(光谱橙色),可以检测所有可能的易位。
将10微升探针应用于中期玻片,并在75℃下共变性7分钟。在37℃下过夜杂交并洗涤后,用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)对染色体进行复染,并使用Axioskop蔡司进行观察®荧光显微镜和图像由CCD摄像机(Cytovision,AppliedMaging)拍摄®).
我们使用SALSA MLPA probemix试剂盒P245-A2 (MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands),包括探针靶向SNRPN和UBE3A基因,根据方法描述和制造商推荐[8]。该试剂盒包含位于PWS/AS关键区域的4个探针和位于15q24.1的2个控制探针。进行归一化处理,并将峰高与合成对照进行比较。只有当峰值低于0.75时才考虑删除。对于碎片的分析,我们使用ABI PRISM®310基因分析仪(应用生物系统),内部尺寸标准ROX-500。使用Coffalyser (MRC-Holland)软件进行数据解释。
多态标记的基因分型
利用位于15q11q13区域的多态性标记,采用标准方法进行PCR,验证父系单亲本二体。从着丝粒到端粒共使用11个微卫星标记:D15S11、D15S646、D15S128、D15S1506、D15S122、D15S210、D15S986、D15S97、GABRB3、D15S966、D15S642[9-10-11]。其中8个(D15S11、D15S646、D15S128、D15S1506、D15S122、D15S210、D15S986和GABRB3)位于临界区。PCR产物在ABI PRISM上进行30分钟毛细管电泳分离®310基因分析仪(应用生物系统)在15千伏使用36厘米毛细管和POP4聚合物。
临床特点
我们患者的性别、确诊时年龄、主要临床特征、细胞遗传学和分子分析结果见表1。
所有患者均表现出严重的言语障碍或言语缺失、严重的发育迟缓、运动和行为异常。9例(81.81%)能独立坐,2例(18.1%)能独立行走,9例不能独立行走。其中8人(72.7%)不能说话,3人(27.2%)能说一些有意义的单词。
我们的患者最常出现畸形的面部特征,如枕沟、突出的舌头、间隔较宽的牙齿、前突(表2)。始终存在共济失调步态。所有患者都有癫痫发作,并正在接受抗癫痫治疗。3名患者的癫痫发作完全得到控制,8名患者的癫痫发作部分得到控制(表2)。
表2。比较我们11例突尼斯AS患者与文献报道的UPD/15q11q13缺失不同AS患者的临床特征。缩写:M:男,F:女,ND:不确定。
本研究 |
不同的研究 |
分析了 参数 诊断时 |
删除 (10例) |
乌利希期刊指南 (1例) |
13 AS的值 病人 报道了 Tan等[28] |
1的值作为 忍受 UPD报告人 Horvath等人[29] |
值的作为 患者 删除报告人 Varela Monica等人[27] |
一的价值 当病人 UPD报告人 弗里曼等人[20] |
诊断时的年龄(月) |
|
|
|
|
|
|
0-24 |
3. |
|
0 |
1. |
ND |
1. |
的技能 |
3. |
1. |
5. |
- |
ND |
- |
37-60 |
3. |
|
8. |
- |
ND |
- |
61-96 |
1. |
|
0 |
- |
ND |
- |
性别 |
7米/ 3 f |
F |
8米/ 5 f |
M |
29M/20F |
M |
产妇年龄(范围) |
34 |
43 |
ND |
ND |
27 |
31 |
父亲的年龄(年) |
38 |
49 |
ND |
ND |
32 |
ND |
出生体重(平均-g) |
3135 |
2500 |
2140 |
3260 |
2981 |
4100 |
张力减退 |
7/10 (70%) |
+ |
0/13 (0%) |
+ |
33/45 (73.33%) |
+ |
脖子上的支持 |
8/10 (80%) |
+ |
ND |
+ |
7 /12 |
+ |
坐着不支持 |
8/10 (80%) |
+ |
ND |
+ |
ND |
+ |
没有演讲 |
10/10 (100%) |
- |
13/13 (100%) |
+ |
43/47 (91.5%) |
+ |
发育迟缓 |
10/10 (100%) |
+ |
12/13 (92%) |
+ |
49/49 (100%) |
+ |
严重的精神发育迟滞 |
10/10 (100%) |
+ |
12/13 (92%) |
+ |
49/49 (100%) |
+ |
头小畸型 |
8/10 (80%) |
+ |
8/13 (62%) |
+ |
25/46 (54.35%) |
- |
巨口 |
7/10 (70%) |
- |
ND |
+ |
47/47 (100%) |
- |
临床发作 |
10/10 (100%) |
+ |
6/13 (46%) |
- |
42/47 (89.4%) |
- |
枕槽 |
8/10 (80%) |
+ |
ND |
+ |
17/23 (73.9%) |
+ |
伸出舌头 |
8/10 (80%) |
+ |
ND |
+ |
28/40 (70%) |
- |
宽齿距 |
8/10 (80%) |
- |
9/13 (69%) |
+ |
34/39 (87.2%) |
+ |
Prognatism |
8/10 (80%) |
+ |
3/13 (23%) |
- |
ND |
+ |
头发或皮肤颜色异常浅 |
3/10 (30%) |
+ |
3/13 (23%) |
- |
- |
+ |
容易引起笑声 |
7/10 (70%) |
+ |
8/13 (62%) |
+ |
46/48 (95.8%) |
+ |
多动 |
8/10 (80%) |
+ |
ND |
- |
33/35 (94.3%) |
- |
胃食管反流 |
5/10 (50%) |
- |
9/13 (69%) |
- |
ND |
- |
共济失调步态 |
10/10 (100%) |
+ |
8/13 (62%) |
- |
27/29 (93.1%) |
+ |
经常流口水 |
5/10 (50%) |
+ |
10/13 (77%) |
+ |
32/33 (96.9%) |
+ |
有睡眠困难史 |
8/10 (80%) |
+ |
12/13 (92%) |
+ |
29/36 (80.5%) |
+ |
对水的迷恋 |
8/10 (80%) |
+ |
8/13 (62%) |
|
ND |
- |
自闭症行为 |
4/10 (40%) |
- |
0/13 (0%) |
- |
ND |
- |
所有患者均进行了头颅MRI检查。其中8例正常,但3例患者出现轻微脑萎缩(表2)。代谢筛查结果显示所有患者均正常。
染色体分析与FISH
所有患者外周血核型均为正常染色体:按性别(男7例,女4例)分别为46,XX或46,XY。同样,所有亲本的细胞遗传学分析都是正常的,排除了包括15号染色体的染色体重排。
鱼分析外周血淋巴细胞与特定探测器(D15Z1 / SNRPN / PML)披露的存在删除15 q11.2-q13地区10个病人男性和3女性(7)(表1)。从父母对淋巴细胞的研究揭示了正常杂交模式,没有发现任何删除或重新排列的影响染色体,确认15q11.2-q13缺失。
微卫星分析
经微卫星分析(图1),只有一名FISH未删除的患者(患者编号8,表1)表现出两条父系15号染色体的遗传,而没有母系15号染色体的遗传。标记物的分离分析显示15号染色体上所有位点均为纯合。他被归类为父系同二体。
图1。UPD患者家族的微卫星分析和系谱。患者(II1)15号染色体片段(D15S11、D15S646、D15S128、D15S1506、D15S122、D15S210、D15S986、D15S97、GABRB3、D15S966、D15S642、D15S11、D15S646、D15S128、D15S1506、D15S122、D15S210、D15S986)的微卫星分析表明患者(II1)她从父亲那里继承了15条染色体的相同拷贝,没有母亲的15条染色体
MS-MLPA分析
在10例患者中,母体缺失15q11.2-q13被证实,而位于15q24.1的对照探针剂量正常。唯一的异oupd患者显示异常的甲基化谱。所有亲本血液dna结果均正常(数据未显示)。
复杂表观遗传缺陷的检测是分子诊断中的一个新兴领域。在实验室中有多种方法用于确定临床诊断阿斯伯格综合症。这些方法包括FISH、微卫星分析、Southern Blot和MS-MLPA,各有优缺点。在本研究中,我们对11例AS患者进行了MS-MLPA检测的分子分析。从分子技术得到的结果显示完全一致,在所有病例的诊断相同。
AS是一种罕见的神经发育障碍,最新估计其发病率在1/ 22000至1/ 52000之间[9-14],而以往的研究认为其发病率在1/10.000至1/20.000之间[15-17]。突尼斯人口中阿斯伯格综合症的患病率以前没有任何研究报道。
根据Williams CA等人的研究,AS的临床特征通常在婴儿晚期才重要[1]。后来,他们的特点是特殊的面部特征与巨大裂口和宽间隔的牙齿。我们这组患者的出生体重和头围正常,足月分娩正常。我们发现80%的病例出现小头畸形,严重智力低下(100%)、言语障碍(100%)、共济失调(100%)和癫痫(100%)(表2)。所有病例都表现出快乐的性格,经常微笑或有时看起来不合适的大笑,易激动的性格,手拍打,共济失调的步态,手臂弯曲并支撑在肘部,睡眠障碍,镜子反射和爱水。每次脑电图均异常。我们的结果证实了smith等人[18]的发现。
Angelman综合征是由15q11-q13 Prader-Willi综合征(PWS)和AS关键区域的表观遗传缺陷引起的。它可能由不同的遗传机制引起。大多数AS病例是由于15q11-q13母体缺失所致。如果母体染色体没有重排,估计该病例的复发风险<1%[19].第二个原因是父系15号染色体的单亲二体。在其余病例中,UBE3A基因突变或印痕中心异常可能是该病的原因。确定其中一方的责任对提供准确的生殖遗传咨询至关重要。核型、FISH、Southern Blot、微卫星分析和MS-MLPA等技术已被用于as的遗传诊断。
在目前的研究中,我们分析了11名来自突尼斯非亲属的患者,他们与AS表型相一致。10名患者被FISH确认为15q11q13染色体缺失,1名患者被微卫星单倍型研究证实为UPD(表1)。他在其父为杂合子的所有位点上都是纯合的,这表明结构重排是由15q等二体引起的。此前报道过少数由异二体15q相关UPD引起的AS病例。大多数是异二体的。之前没有观察到异质性或iso-UPD两种机制之间的表型差异[20-23]。
多重连接依赖性探针扩增(MLPA;MRC Holland,阿姆斯特丹,荷兰)是一种检测各种遗传疾病中缺失和/或重复的技术[24,25]。对于微缺失综合征,MLPA试剂盒允许检测多个染色体区域(1p36、7q11.23、17p11.2、17 p13.3、22q11.21、15q11.2、20p12、7p21.1和5q35.3)的拷贝数变化。因此,MLPA可以通过同时研究不同的染色体区域来显著缩短这一过程。在这项研究中,我们将MLPA作为一种诊断试验,然后与细胞遗传学研究和FISH进行比较,评估其性能。
MS-MLPA的原理与MLPA基本相似,不同的是MS-MLPA探针检测到的目标序列包含一个被胞嘧啶甲基化敏感的内切酶(如HhaI或HpaII)识别的限制性位点。用这些酶中的一种进行消化,只有CpG位点被甲基化时才能获得探针扩增产物。甲基化水平是通过计算每个靶探针从消化和未消化样品的相对峰面积的比例来确定的。
MS-MLPA结果显示FISH先前检测到的10名患者的杂合子缺失。该缺失带走了15q11q13基因座的母亲功能性拷贝。父亲的剩余拷贝被甲基化且无功能性。在一名患者(N°8)中,我们发现异常甲基化谱。
有几个方面有助于MS-MLPA的益处:(i)可以使用最少20 ng样本DNA研究大量基因,(ii)由于其程序简单,可以同时分析大量样本;(iii)MS-MLPA是半定量的,可以区分拷贝数(缺失或重复),并区分一个、两个或两个等位基因的甲基化。
AS的临床严重程度与其遗传机制类型之间的相关性有限。有较大染色体缺失的患者更有可能出现小头畸形和癫痫,更有可能出现眼睛、头发和皮肤色素减退[26]。那些单亲二孩的人更有可能有正常的头围,没有癫痫,和更好的认知功能,尽管严重到严重的损害仍然存在。有IC和UBE3A上述前一种机制和后一种机制[1-27]之间的缺陷更可能具有中度临床严重性,将49例患者的临床症状描述为缺失患者,并得出结论,在UPD患者中可以观察到缺失患者中观察到的表型变异,但这两组之间存在一些差异,包括步态改善和UPD中癫痫发作的低发生率。与UPD、印迹突变和基因突变患者相比,位于缺失染色体片段的基因单倍体不足可能是导致缺失患者更严重表型和行为特征的原因UBE3A基因突变。这些发现与观察结果一致,即在我们的患者中,UPD的表型较不严重(表2).尽管我们的一系列患者表现出较不严重的表型,但所有患者都表现出严重的言语延迟和特征性行为。没有患者表现出超过两个有意义的单词,AS的核心表型可能是言语和/或表达性语言功能障碍,以及特征性行为。
利用MS-MLPA可迅速获得AS临床诊断的确认。此外,拷贝数状态可以与甲基化状态同时确定,因此可以将缺失病例与UPD或IC缺陷病例区分开来。可能需要单倍型研究来确定UPD是否是综合征的原因。
MS-MLPA技术用于检测AS的大多数异常,证明是一种健壮、适用和简单的方法,用于大规模的DNA分析,提供正确的遗传诊断,对理解疾病机制和进行适当的遗传咨询是必不可少的。
我们谨对所有作出贡献的家庭的合作和慷慨表示感谢。我们要感谢La Rabta医院突尼斯神经儿科部所有团队成员的努力。我们也感谢Ahlem Msakni女士,Sihem Sassi女士和Safa Bouker女士的出色技术支持。
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