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摘要gydF4y2Ba

利用高压电势(HELP)产生电场(EF)的医疗设备进行替代疗法在日本很常见。然而，这种疗法潜在的健康益处的机制仍不清楚。因此，我们研究了HELP暴露(9 kV/电极+ 9 kV/电极，30分钟)对皮肤的影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基丝氨酸(gydF4y2BaNgydF4y2Ba-使用选定反应监测（SRM）分析从健康人受试者单次治疗前后获得的血浆样本中的酰基SERs）。gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER在HELP暴露后显著上调。在这些条件下，HELP暴露没有发挥水平gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba20:4爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba22:6爵士。因为gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1乙醇胺（gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA）已知可激活瞬时受体电位香草醛1（TRPV1）和过氧化物酶体增殖物激活受体-gydF4y2BaαgydF4y2Ba（PPAR-α），我们进一步研究了gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba利用TRPV1和PPAR-α进行对接仿真。与TRPV1的结合能分别为-6.359和-6.227 kcal/molgydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba分别为18:1 EA。与PPAR-α的结合能分别为-7.366和-6.956 kcal/molgydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba分别为18:1 EA。在人类HepG2细胞中，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 Ser增强脂肪酸结合蛋白1（FABP1）mRNA表达。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER诱导的FABP1 mRNA表达对PPAR-α拮抗剂GW6471敏感。我们的发现为EF治疗的健康益处的分子机制提供了新的见解。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba-gydF4y2Ba油酰丝氨酸gydF4y2Ba，gydF4y2BaN-palmitoyl丝氨酸gydF4y2Ba，gydF4y2BaN-oleoyl乙醇胺gydF4y2Ba，gydF4y2BaTRPV1, PPAR-agydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

ACOX1:过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1;DSPS:睡眠相延迟综合症;电子商务gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba:最大有效浓度的一半;英孚:电场;费尔南多-阿隆索:脂肪酸;FABP1:脂肪酸结合蛋白1;帮助:高压电势;蚯蚓:hydroxyoctadecadienoic酸;IL:白介素;MSL:多发性良性对称型脂肪瘤;gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2 EA:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-LINOLEYL乙醇胺;gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 EA:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-油酰乙醇胺；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16：0 ea：gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Palmitoyl乙醇胺;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:0 EA:gydF4y2BaNgydF4y2Ba硬脂酰乙醇胺;NF -κB:核因子-gydF4y2Ba卡巴gydF4y2BaB;NLRP3:节点样受体蛋白3;gydF4y2BaNgydF4y2Ba20:4 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-花生四烯基丝氨酸；gydF4y2BaNgydF4y2Ba22:6 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-二十二碳六烯基丝氨酸；gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-linoleoyl丝氨酸;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba-leleyl丝氨酸;gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba棕榈酰丝氨酸;gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:0 SER:gydF4y2BaNgydF4y2Ba硬脂酰丝氨酸;PLAAT:磷脂酶/酰基转移酶;中国人民解放军gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba:磷脂酶gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba；PPAR-α:过氧化物酶体增殖物激活受体gydF4y2BaαgydF4y2Ba；qRT-PCR:实时定量聚合酶链反应;SRM:选择性反应监测;TLR4: toll样受体4;TRPV1:瞬时受体电位香草醛1。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

高压电场（EF）疗法可能是治疗肩部僵硬、头痛、失眠和慢性便秘的有效方法[1-19]。虽然EF疗法是在大约90年前被发现的，但与其健康益处相关的分子机制仍然难以捉摸。日本卫生、劳动和福利部批准了一种将人体暴露在高压电势（HELP）下的治疗装置[1-19]。文献回顾表明，帮助暴露可能是几种情况下的替代疗法。我们以前尝试使用液相色谱（LC）-飞行时间质谱法寻找接触诱导的血浆生物标记物，结果检测到了脂质，如棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、，gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba8、11 14-eicosatrienoic酸(DGLA),gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba5、8、11、14 17-eicosapentaenoic酸,和gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-4,7,10,16,16,19-二十二碳六烯酸[12]。定量脂质介质的最近方法已利用选定的反应监测（SRM）分析[17,18]。使用SRM，我们显示出增强的有助暴露诱导的脂质水平，包括溶血磷脂酰胆碱-22：4，溶血膦酰氨基乙醇胺-20：4，在健康个体的血浆中，溶血磷脂酰乙醇胺-22：6 [17,18]。因此，我们假设EF暴露后，磷脂酰乙醇胺水平的血浆Lyso形式的变化可以与变化有关gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基丝氨酸(gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰基ser)。的刺激作用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs，如gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-最近报道的成骨细胞MC3T3 E1细胞中细胞数量的16:0 SER[20]，促使对血浆检测进行研究gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs在健康受试者中使用SRM进行单次HELP刺激。在这项研究中，我们证明了这一点gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2BaHELP暴露(9 kV/电极+ 9 kV/电极，30 min)可上调-16:0 SER。此外，我们进行了gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba对接模拟以探索之间的相互作用gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER和TRPV1或PPAR-α的活性位点gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

EF暴露gydF4y2Ba

如前所述[1-19]，EF曝光由一个配备变压器、一个座椅和两个绝缘体覆盖电极的系统组成。一个电极被放置在地板上，靠近受试者的脚，而另一个被放置在头部。HELP仪器生成的EF (Healthtron PRO-18T;日本东京白州健康科学研究所(Hakuju Institute for Health Science Co.， Ltd.， Japan, Tokyo)是将50hz交流电在9kv /电极+ 9kv /电极上进行转换而成的。日本政府在1963年证实了该系统对人类使用是安全的。gydF4y2Ba

主题gydF4y2Ba

五十七名健康成人（23名男性和34名女性;平均年龄，46.6±0.9岁;体重指数[BMI]，22.1±0.6千克/米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)自愿参加实验1（暴露条件：9 kV/电极+9 kV/电极，30分钟）。32名健康成人（11名男性和21名女性；平均年龄46.4±1.3岁；体重指数22.5±0.9 kg/m）gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)自愿参加实验二(暴露条件:9kv /电极+ 9kv /电极，30分钟)。所有的参与者在收到关于研究的口头和书面信息后签署了一份知情同意书。所有的实验都是在早上进行的。所有试验都是根据《赫尔辛基宣言》进行的。该研究方案得到了日本东京白州健康科学研究所人类伦理委员会的批准。gydF4y2Ba

等离子体的准备gydF4y2Ba

采血使用乙二胺四乙酸(VP-NA070K;Terumo公司，东京，日本)，并立即在800倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟，将血浆与其他多孔材料分离。随后将血浆转移到新鲜的Eppendorf管中，并在-80℃下储存，直至处理。gydF4y2Ba

固相萃取的gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基酰胺gydF4y2Ba

固相萃取的gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰基ser和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基乙醇胺(n -酰基EAs)，如先前报道的，经过少量修饰[21]。简单地说,5 pmolgydF4y2BaNgydF4y2Ba-花生四烯基-L-丝氨酸-d8（美国密歇根州安娜堡开曼化学公司）和25 pmolgydF4y2BaNgydF4y2Ba-将花生四烯基乙醇酰胺-d8（Cayman Chemicals，美国密歇根州安娜堡）作为内标物添加到血浆（250µL）中。通过在冰上添加1 ml乙腈15分钟，然后在4°C下以5000 rpm离心5分钟，沉淀蛋白质。上清液用0.005N盐酸在水中稀释。Oasis HLB 60 mg Vac RC柱（美国马萨诸塞州米尔福德市沃特斯）通过真空歧管（美国马萨诸塞州米尔福德市沃特斯市沃特斯）在水中用甲醇和0.005N HCl进行预处理。将稀释的萃取物施加到柱上，并用3 ml 0.005N盐酸在水中清洗，然后用20%（v/v）乙腈清洗。最后gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基酰胺用1ml乙腈从柱中洗脱，在N恒流下干燥gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在40µL的70% (v/v)甲醇中，转移到样品瓶中。gydF4y2Ba

LC-MS/MS分析gydF4y2Ba

注入20µL等分的脂质样品，并在30℃下使用梯度溶剂系统在Waters X-Bridge C18（美国马萨诸塞州米尔福德Waters公司，3.5µm，150 mm X 1.0 mm内径）上分离脂质，如下所示：流动相A[乙腈/甲醇（4:1，v/v）]/流动相B[添加0.1%乙酸的LC-MS级蒸馏水]比例为50%/50%（0－5分钟）、50%/50%（5分钟）、100%/0%（20－25分钟）、50%/50%（25－30分钟）。流速为80µL/min。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基酰胺用SRM在负模式下测定gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs，在正离子模式下为gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 用液相色谱仪质谱仪LCMS-8040（日本Shimadzu）的亚乙基ea。SRM M / Z过渡是：gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 ser = 342.3/74.1;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:0 ser = 370.3/74.1;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 Ser = 368.3 / 74.1;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 SER=366.3/74.1；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-20:4 SER=390.3/74.1；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-22:6 SER=414.3/74.1；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 ea = 300.3/62.2;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:0 ea = 328.3/62.2;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 ea = 326.3/62.2;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 ea = 324.3/62.2。gydF4y2Ba

同源建模与对接仿真gydF4y2Ba

我们使用Q8NER1。fasta在UniProt中注册，获得human TRPV1 (hTRPV1)序列。三维结构(3J5R;蛋白质数据库日本)作为模板结构。通过辣椒素(TRPV1激动剂)与同源模型对接计算，选择最佳对接评分。对接研究gydF4y2BaNgydF4y2Ba使用AutoDock Vina对接软件(Dr. Oleg Trott, the Scripps Research Institute, CA, USA)[22]完成-酰基SERs与hTRPV1模型结构的靶蛋白的结合。对接实验进行了5次，得到了100个候选构象。gydF4y2Ba

核PPAR-对接研究gydF4y2Baα　

PPAR-α复合物的X射线晶体结构与GW735（2P54;蛋白质数据库日本）用于分子对接[23]。对接研究gydF4y2BaNgydF4y2Ba使用AutoDock Vina对接软件(Dr. Oleg Trott, the Scripps Research Institute, CA, USA)[23]完成-酰基SERs与hPPAR- α模型结构的靶蛋白的结合。对接实验进行了5次，得到了100个候选构象。gydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)gydF4y2Ba

人肝癌HepG2细胞取自ATCC (HB-8065, Rockville, MD, USA)。细胞在含有10%胎牛血清(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, USA)、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)的rmi -1640 (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan)中培养，在5%的湿润CO中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba气氛在37gydF4y2Ba^O.gydF4y2BaC. HepG2细胞(30000个细胞/孔)传代并接种于96孔板(Sumitomo bakelite, Tokyo, Japan)。孵育24h后，用其中一种处理细胞gydF4y2BaNgydF4y2Ba-leleyl-l-l-丝氨酸（Cayman Chemical，Ann Anrbor，Mi，USA），或GW6471（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo，USA）或两者均为24小时。用载体（0.5％乙醇）处理的细胞用作对照。如前所述[12,15]进行QRT-PCR。使用Fastlane Cell cDNA试剂盒（Qiagen，valencia，Ca，USA）分离出总RNA，并根据制造商的说明，使用Quantitect逆转录试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）反转以互补的DNA（cDNA）转录。使用Sybr Green Premix前Taq II（Takara Bio Inc.，Otsu，Japan），在Lightcyler 96系统（Roche Applical Science，Mannheim，Mannheim，Mannheim，Mannheim，Mannheim，Mannheim）进行QRT-PCR。基因表达水平通过Delta-Delta-CT方法计算。将数据作为相对表达单位呈现给甘氨醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的归一化后。底漆集的序列（5'至3'）是gydF4y2BaFABP1gydF4y2Ba-f, atg agt TTC TCC GGC aag tac c;gydF4y2BaFABP1gydF4y2Ba-R、 CTC TTC CGG CAG ACC GAT TG；gydF4y2BaACOX1gydF4y2Ba-f, gta TGG aat cag tca gaa cgc;gydF4y2BaACOX1gydF4y2Ba-R、 CTT GTA AGA TTC GTG GAC CTC；以及gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba-F、 CAT CCC TGC CTC TAC TGG CGC TGC；gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba-R、 CCA GGA TGC CCT TGA GGG GGC CCT C；gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据使用Welch的方法进行分析gydF4y2BaT.gydF4y2Ba以及。一个概率(gydF4y2BaP.gydF4y2Ba）值<0.05被认为是统计学意义的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

效果gydF4y2Ba属于gydF4y2Ba帮助曝光gydF4y2BaO.gydF4y2BaNgydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs在健康人血浆中的表达gydF4y2Ba

我们分析了HELP暴露(9 kV/电极+ 9 kV/电极)30 min的影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs(图1)gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1与暴露前相比，HELP暴露后的时间-0 SER显著上调(gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 SER: 1.42倍,gydF4y2BaP.gydF4y2Ba=0.0305;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1系列：1.49折，gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0315)。在这些条件下，HELP暴露不会影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba20:4爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-22:6 SER(图1)。gydF4y2Ba

图1。gydF4y2Ba帮助暴露（9kV /电极+ 9kV /电极，30分钟）的影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-健康人血浆中的酰基SERs。（a） 典型的gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1健康人血浆中SER峰值gydF4y2BaNgydF4y2Ba-SRM分析检测到18:1的SER。（b）蛋白质的结构gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1爵士。(c)典型gydF4y2BaNgydF4y2Ba-SRM分析检测到16:0 SER峰值。（d） 结构gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士。(e)gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs在暴露前后的等离子体。数据用平均值±SE表示(n=57英寸)gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 SER;n = 43gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:0 SER;n = 57gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER；n=52英寸gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2 SER;n = 24gydF4y2BaNgydF4y2Ba20:4 SER;n = 40gydF4y2BaNgydF4y2Ba-22:6）。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER在插图中表示为平均值±SE*gydF4y2BaP.gydF4y2Ba< 0.05gydF4y2Ba

效果gydF4y2Ba属于gydF4y2Ba帮助曝光gydF4y2BaO.gydF4y2BaNgydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基EAs在健康人血浆中的含量gydF4y2Ba

因为gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs在结构上类似于gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基EAs，我们接下来分析了帮助暴露（9 kV/电极+9 kV/电极）30分钟对患者的影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰EAs(图2)gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-与接触前相比，18:2 EA在接触帮助后30分钟的时间点显著上调(gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 EA: 1.24倍,gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0300;gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 EA: 1.27倍,gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0285;gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2 EA: 1.34倍,gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0170)。在这些条件下，HELP暴露不影响gydF4y2BaNgydF4y2BaEA(图2)。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2Ba帮助暴露（9kV /电极+ 9kV /电极，30分钟）的影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-健康人血浆中的酰基EA。gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 血浆中的anc。数据表示为平均值±se（n = 32gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16：0 ea在30分钟之前和之后;n = 32gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:0 30分钟前后EA;n = 32gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 30分钟前后EA;n = 27gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA, 30分钟前后)。＊gydF4y2BaP.gydF4y2Ba< 0.05gydF4y2Ba

船舶对接仿真gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA，或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA与TRPV1同源模型gydF4y2Ba

NgydF4y2Ba18:1 EA和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA引起表达hTRPV1[24]的HEK293细胞内钙的增加。因此，我们假设增加的血浆gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2BaHELP暴露后SER水平可能与其作为内源性TRPV1激动剂的激活有关。我们检查了gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER，或众所周知的TRPV1激动剂辣椒素，使用AutoDock Vina软件[25-27]在TRPV1的活性部位。我们将输出姿势数设置为20，共有100个候选构象。辣椒素显示出-7.915 kcal/mol的强相互作用能（表1）.辣椒素与Thr-550、Ser-512和Glu-570形成氢键（图3a，表1）。在这些条件下，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER显示出良好的结合能为-6.359 kcal/mol（表1）。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER与Thr-550、Ala-666形成氢键(表1，图3b)。使用9-HODE获得了类似的对接评分gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER(表1)。9-HODE是TRPV1的内源性激动剂，与Thr-550、Ala-666形成氢键(表1，图3c)。此外,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER表现出良好的结合能-6.077 kcal/mol(表1)。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER与Thr-550、Ala-666形成氢键(表1，图3d)。随后，我们检查了gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基EAs检测TRPV1活性位点的特异性。结合能分别为-6.421、-6.227和-5.767千卡/molgydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：2 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-分别为16:0 EA（表1）。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba分子对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA, 9-HODE，或含有TRPV1的辣椒素gydF4y2Ba．gydF4y2Ba(a) TRPV1同源性建模中辣椒素的结合模式;辣椒素(青色)氨基酸(白色)在口袋里，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。辣椒素酰胺部分的羧基与Thr-550侧链上的羟基形成氢键。辣椒素香草醛部分的甲氧基与Ser-512侧链上的羟基形成氢键。辣椒素香草酸部分的羟基与胶-570侧链上的羟基形成氢键。（b）绑定模式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER在TRPV1的同源建模中。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER(青色)氨基酸(白色)口袋，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。羧基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1甲酰胺部分与Thr-550的侧链中的羟基形成氢键。羟基的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1丝氨酸部分与Ala-666主链中的羰基形成氢键。（c） TRPV1同源模拟中9-HODE的结合模式；口袋中的9-荷德（青色）氨基酸（白色）、氢键（黄色虚线）和氢键伙伴氨基酸（品红）。9-HODE羧基中的氧原子与Thr-550的羟基形成氢键。9-HODE的羟基与Ala666主链中的羰基形成氢键。（d） 绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER在TRPV1同源建模中的应用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER(青色)氨基酸(白色)在口袋里，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。羧基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER酰胺部分与Thr-550侧链上的羟基形成氢键。羟基的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER丝氨酸部分与Ala-666主链上的羰基形成氢键。(e)的绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea在TRPV1的同源性建模中;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA(青色)氨基酸(白色)在口袋里，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。羧基gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰胺与tyr511羟基形成氢键。羧基gydF4y2BaNgydF4y2Ba酰胺与tyr554羟基形成氢键。(f)的绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2BaTRPV1同源建模中的-16:0 EAgydF4y2BaNgydF4y2Ba-口袋中的16:0 EA（青色）氨基酸（白色）、氢键（黄色虚线）和氢键伙伴氨基酸（品红）gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA与tyr554羟基形成氢键gydF4y2Ba

表1。gydF4y2BaTRPV1的对接分数和关键相互作用残基gydF4y2Ba

配体gydF4y2Ba	对接的分数gydF4y2Ba	交互式残留gydF4y2Ba
	(千卡每摩尔)gydF4y2Ba
TRPV1受体激动剂gydF4y2Ba
辣椒素gydF4y2Ba	-7.915gydF4y2Ba	Ser-512、Thr-550和Glu-570gydF4y2Ba
内源性TRPV1受体激动剂gydF4y2Ba
9-HODEgydF4y2Ba	-6.496.gydF4y2Ba	用力推- 550,ala - 666gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba酰基丝氨酸gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-18:1赛尔gydF4y2Ba	-6.359.gydF4y2Ba	用力推- 550,ala - 666gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-16:0赛尔gydF4y2Ba	-6.077gydF4y2Ba	用力推- 550,ala - 666gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba酰基乙醇胺gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-18:1 EAgydF4y2Ba	-6.227gydF4y2Ba	酪氨酸- 511和酪氨酸- 554gydF4y2Ba
NgydF4y2BaEA 16:0gydF4y2Ba	－5.767gydF4y2Ba	酪氨酸- 554gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba18:2 EAgydF4y2Ba	－6.421gydF4y2Ba	glu - 570gydF4y2Ba

船舶对接仿真gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA，或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA和PPAR模型-gydF4y2BaαgydF4y2Ba

NgydF4y2Ba-18:EA被认为是PPAR-α的内源性激活剂，可诱导脂解[13,28-29]gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER或一种著名的PPAR- α激动剂bezafibrate，利用AutoDock Vina软件[30]检测PPAR- α活性位点。我们设置输出姿态的数量为20，总共有100个候选构象。Bezafibrate与Ser-280、tyr314、His-440和tyr464形成氢键(图4a，表2)。在此条件下，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 Ser显示出良好的结合能量-7.366 kcal / mol（表2）。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER与SER-280、Tyr-314和His-440形成氢键（图4b，表2）。此外gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER的结合能为-7.161 kcal/mol(表2)。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16：0与SER-280，TYR-314和TYR-464的Ser形成的氢键（图4C，表2）。使用类似的对接得分gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 EA而不是gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER(表2)。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA与Ser-280、tyr314、His-440形成氢键(图4d，表2)gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16：0 ea和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA测定PPAR-α活性位点的特异性。结合能分别为-6.570和-6.979(表2)。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba分子对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：2 EA，或具有PPAR-α的Bezaf纤维。（a）PPAR-α建模中BezafBribrate的结合模式;Bezafbibrate（青色）袋中的氨基酸（白色）在口袋中，氢键（黄色虚线）和氢键合伴侣氨基酸（洋红色）。碳酸贝扎纤维部分与Ser-280的羟基形成氢键。BezafBibrate的碳酸部分与Tyr-314羟基形成氢键。碳酸贝扎吡酸盐部分与他-440氮原子形成氢键。碳酸贝扎纤维部分与Tyr-464羟基形成氢键。（b）绑定模式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER在PPAR- α模型中的应用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-口袋中的18:1丝氨酸（青色）氨基酸（白色）、氢键（黄色虚线）和氢键伙伴氨基酸（品红）。碳酸gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER部分与SER -280羟基形成氢键。的碳酸gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER部分与tyr314羟基形成氢键。的碳酸gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER部分与His-440氮原子形成氢键。(c)的约束方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-PPAR-α模型中的16:0ser；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER(青色)氨基酸(白色)在口袋里，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。氮原子gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER与SER -280羟基形成氢键。的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER与Tyr-314羟基形成氢键。碳酸gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER部分与tyr464羟基形成氢键。(d)的绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA在PPAR- α模型中的应用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA(青色)氨基酸(白色)在口袋里，氢键(黄色虚线)和氢键伙伴氨基酸(品红)。氮原子gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1的EA与Ser-280羟基形成氢键。电子探针顶端的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA与tyr314羟基形成氢键。顶端的羟基gydF4y2BaNgydF4y2BaEA与His-440氮原子形成氢键。(e)的绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-PPAR-α模型的16:0ea；gydF4y2BaNgydF4y2Ba-口袋中16:0 EA（青色）氨基酸（白色）、氢键（黄色虚线）和氢键伙伴氨基酸（品红）。氮原子gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA与ser280羟基形成氢键。顶端的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA与tyr314羟基形成氢键。(f)的绑定方式gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：2在PPAR-α的建模中的EA;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-口袋中的18:2 EA（青色）氨基酸（白色）、氢键（黄色虚线）和氢键伙伴氨基酸（品红）gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA与tyr314羟基形成氢键。顶端的羟基gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA与tyr314羟基形成氢键。顶端的羟基gydF4y2BaNgydF4y2BaEA与His-440氮原子形成氢键gydF4y2Ba

表2。gydF4y2BaPPAR-α的对接分数和关键相互作用残基gydF4y2Ba

配体gydF4y2Ba	对接的分数gydF4y2Ba	交互式残留gydF4y2Ba
	(千卡每摩尔)gydF4y2Ba
PPAR-α激动剂gydF4y2Ba
苯扎贝特gydF4y2Ba	-9.323gydF4y2Ba	Ser-280、Tyr-314、His-440和Tyr-464gydF4y2Ba
n -丝氨酸gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-18:1赛尔gydF4y2Ba	-7.366gydF4y2Ba	Ser-280、Tyr-314和His-440gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-16:0赛尔gydF4y2Ba	-7.161gydF4y2Ba	Ser-280、Tyr-314和Tyr-464gydF4y2Ba
N-酰基乙醇胺gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba-18:1 EAgydF4y2Ba	－6.956gydF4y2Ba	Ser-280、Tyr-314和His-440gydF4y2Ba
NgydF4y2BaEA 16:0gydF4y2Ba	-6.570gydF4y2Ba	SER-280，TYR-314gydF4y2Ba
NgydF4y2Ba18:2 EAgydF4y2Ba	－6.979	酪氨酸- 314 - 440gydF4y2Ba

影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER对人肝癌HepG2细胞FABP1 mRNA表达的影响gydF4y2Ba

由于FABP1和过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1 (peroxisomal酰基辅酶A oxidase 1, ACOX1)是PPAR-α响应基因[12,31]，因此我们进一步证实了其作用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-使用qRT PCR对FABP1 mRNA进行18:1 SER处理（图5a）。在人类HepG2中，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER使FABP1mRNA表达量呈剂量依赖性增加(gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 Ser-10μm：1.48倍，gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0164;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER-30 μ M: 1.98倍gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0112;gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER-100µM: 2.02倍，gydF4y2BaP.gydF4y2Ba=0.0009). 接下来，我们确定了众所周知的PPAR-α激动剂苯扎贝特是否模拟了gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER在人HepG2细胞中的表达。Bezafibrate显著增强FABP1 mRNA的表达(Bezafibrate -10µM: 2.86倍，gydF4y2BaP.gydF4y2Ba= 0.0119)。我们也检验了gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER对人HepG2细胞ACOX1 mRNA表达的影响。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER增加了ACOX1 mRNA的表达(图5b)。我们进一步评估PPAR-α拮抗剂GW6471是否能减弱其作用gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 ser刺激FABP1表达。gydF4y2BaNgydF4y2Ba-30µM GW6471几乎完全消除了18:1 SER（30µM）刺激的FABP1反应（图5c）。gydF4y2Ba

图5。gydF4y2Ba影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER对人肝癌HepG2细胞FABP1和ACOX1 mRNA表达的影响。qRT-PCR分析人HepG2细胞处理后FABP1 (a)和ACOX1 (b) mRNA的表达gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER或bezafibrate作用24h。(c) GW6471对gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 ser诱导人HepG2细胞FABP1 mRNA表达的激活。将GW6471(30µM)加入培养细胞中，分别于培养前30 min和培养时加入gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18-1 SER（30µM）培养（24小时）。甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内部对照。结果以平均值±SE（n=5）表示*gydF4y2BaP.gydF4y2Ba< 0.05与对照组(0.5%乙醇)相比。Arunachal Pradesh，gydF4y2BaP.gydF4y2Ba< 0.01与对照组(0.5%乙醇)相比gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER对健康人急性EF暴露敏感。血液中gydF4y2BaNgydF4y2Ba-人类健康对照组中的18:1 SER与之前通过定量分析获得的结果一致[32]。在我们之前使用非靶向代谢组学进行的筛查中，我们发现EF暴露（9 kV/电极+9 kV/电极）导致的细胞凋亡增加1.24倍gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 EA[12]。在本研究中，使用SRM分析，EF暴露诱导相同脂质部分增加1.27倍。人们对其生物合成知之甚少gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SERs，尽管有些可能gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 已经提出了eas生物合成途径[33]。有趣的是，磷脂酶的一家磷脂酶A /酰基转移酶（PLAAT）有助于gydF4y2BaNgydF4y2Ba已发现-酰基EAs形成[34]。然而，ef引起的变化的详细机制gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18：1 ea，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:2 EA有待阐明。gydF4y2Ba

的分子靶标gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:0 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER是复杂的，可以用几种方式来解释。在本研究中，与TRPV1对接仿真表明gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER具有良好的binding affinity值。结果表明，N-18:1 SER和N-16:0 SER与TRPV1通道结合。埃亨说,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA可在蛋白激酶C激活剂处理后激活TRPV1通道[35]。因此，Tyr-511残基的相互作用在TRPV1的活性位点中不起关键作用。与gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA，检测到与Thr-550形成氢键gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba内源性TRPV1激动剂9-HODE[36]。另一项研究，使用低温电子显微镜观察带有辣椒素结合囊的TRPV1的结构，报道了Thr-550的氢键[26-27]。这些发现表明gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER可能作为TRPV1的内源性激动剂gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道称,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-22:6 SER在trpv1转染的HEK细胞[37]中具有激动剂活性。的激动作用的评价gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 SER在功能测定中可能在未来的研究中得到保证。TRPV1通道是一个已知的药理靶点，可缓解治疗后神经痛[38]的疼痛。特别是,阿南德gydF4y2Ba等gydF4y2Ba. 报道称，使用含有8%辣椒素的Qutenza贴片治疗，可通过解除痛觉感受器的功能产生镇痛效果[39]。博比罗gydF4y2Ba等gydF4y2Ba.最近报道，激活TRPV1通道可通过抑制机械敏感压电通道活性而引发镇痛[40]。因此，有理由推测EF暴露可能通过与TRPV1结合而减轻疼痛gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER、gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士。另一方面，伊藤gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．最近报道trpv1介导的钙信号参与了骨骼肌肥大的诱导[41-42]。虽然在本研究中没有重复EF治疗，但评估HELP暴露对衰老过程中骨骼肌萎缩的可能影响可能是有趣的。gydF4y2Ba

埃伯林gydF4y2Ba等gydF4y2Ba. 报道说一种润肤剂含有gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA改善了前瞻性队列研究[43]中的特应性皮炎症状，而EspositogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道称,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16：0 EA治疗通过Toll样受体4（TLR4） - 依赖性PPAR-α激活改善了溃疡性结肠炎模型中的结肠炎炎症[44]。在本研究中，使用PPAR-α的对接模拟显示gydF4y2BaNgydF4y2Ba-酰基SER具有良好的结合亲和力值gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士。特别是,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER与PPAR-α的结合通过与SER -280、tyr314和His-440形成氢键而稳定。在关键的相互作用残基中，先前的一项研究使用PPAR-α模型(PDB ID:1i7g)与gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA结合袋报告与Ser-280, tyr314和phe273[12]形成氢键。由于FABP1和ACOX1是PPAR-α响应基因[12,31]，我们在本研究中检测了它们的表达。我们之前报道过gydF4y2BaNgydF4y2Ba利用Affymetrix基因芯片人类基因组U133 Plus 2.0阵列[12]，EA诱导FABP6基因表达增加2.8倍。我们目前的研究结果表明gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER (30 αM)诱导人HepG2细胞FABP1 mRNA表达增加约2倍，其被PPAR-α拮抗剂GW6471抑制。因此，HELP暴露可能通过激活PPAR-α来诱导FABP1 mRNA的表达，至少是部分的gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1爵士。gydF4y2Ba

有证据表明PPAR-α激动剂具有独特的药理作用gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba．BrandstatgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道贝茨贝特，如贝茨贝特，氯贝特或非诺贝特，延长成年人的寿命gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba[45]。ZeitlergydF4y2Ba等gydF4y2Ba. 报道称，非诺贝特（200 mg/天）诱导多发良性对称性脂肪瘤病（MSL）患者处于静止状态，其特征是进展迅速[46]。另一方面，ShiraigydF4y2Ba等gydF4y2Ba. 报道称，苯扎贝特缓解了昼夜节律睡眠障碍，如延迟睡眠期综合征（DSPS）[47]。在骨量和破骨细胞形成中，发育迟缓gydF4y2Ba等gydF4y2Ba. 据报道，非诺贝特维持去势大鼠的骨量[48]，而PatelgydF4y2Ba等等。gydF4y2Ba据报道，非诺贝特治疗可诱导培养的小鼠骨髓来源的破骨细胞形成减少[49]。有趣的是gydF4y2Ba等等。gydF4y2Ba观察到gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER刺激成骨细胞MC3T3 E1细胞和原代成骨细胞的增殖gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba[20]还有，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER挽救了卵巢切除术引起的骨丢失gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba[20]。另一方面，Hashimoto报道了EF暴露在杂种兔中激活了愈伤组织的形成gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba模型[50]。此外，有证据表明静态EF暴露刺激人类培养成骨细胞的分化[51]。尽管EF暴露导致骨形成的潜在机制尚待阐明，但证据表明gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER作为内源性信号分子的作用。因此，可以想象gydF4y2BaNgydF4y2Ba英语学习·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读·日积月多阅读在未来，EF治疗对MSL、DSPS和骨量的可能影响应予以评估。gydF4y2Ba

有趣的是，Scuderi.gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报道称,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0 EA通过PPAR-α参与阿尔茨海默病大鼠模型发挥神经保护作用。此外,CampolongogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．报告了培训后管理gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA在大鼠Morris水迷宫中的表现增强记忆巩固这些增强记忆的作用被PPAR-α激动剂GW7647模拟，并在缺乏PPAR-α[54]的突变动物中被消除。因此，我们有理由推测EF治疗通过激活PPAR-α信号通路促进记忆巩固gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 SER，gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0爵士,gydF4y2BaNgydF4y2Ba16:0 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:2 EA,gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1 EA。在未来，评估EF疗法对衰老相关记忆功能的可能影响将是有意义的。gydF4y2Ba

总之，急性HELP暴露对血浆有显著影响gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-16:0健康受试者的SER水平gydF4y2Ba在Silico.gydF4y2Ba分子对接gydF4y2BaNgydF4y2Ba18:1 SER和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-在TRPV1和PPAR-α模型中观察到16:0 SER。在人HepG2细胞中，gydF4y2BaNgydF4y2Ba-18:1丝氨酸刺激的Fabp1mRNA表达对PPAR-α拮抗剂GW6471敏感。我们的发现为深入了解帮助带来的健康益处背后的分子机制提供了依据。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

YN-Y、HH、AH是白州健康科学研究所有限公司的员工;TO和HN受雇于Lipidome Lab Co.， Ltd;EK受雇于Intage Healthcare Inc.;而TY受雇于Acel公司。所有其他作者都没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

YN-Y设计和监督研究，并撰写手稿。YN-Y、HH和AH进行EF暴露。TO和HN进行SRM。EK进行分子建模。TY进行RT-PCR。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

承认gydF4y2Ba

我们感谢菊池诚博士(日本国防医学院名誉教授)的鼓励。gydF4y2Ba

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