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摘要

Usnea longissima Ach这是一种以其保护作用而闻名的地衣。在本研究中，我们观察了橄榄油和茴香酸对兔股骨钛植入后细胞凋亡的影响。我们确定地衣代谢物和橄榄油激活半胱天冬酶依赖性程序性细胞死亡，而不是坏死。口服和局部给药橄榄油和枸杞酸均通过激活caspase 2、3、8和9显示促凋亡作用。此外，它们还表现出较强的髓过氧化物酶(MPO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。然而，iNOS和MPO的活动在局部应用中没有很强的影响。此外，枸杞酸和橄榄油降低了SOD活性和GSH水平。同时，这些组织中钛的植入也减少了。根据获得的数据，usic酸和橄榄油均可诱导凋亡细胞死亡。因此，它可以作为促凋亡剂用于各种疾病的治疗。

关键字

Usnic酸，钛合金，凋亡，半胱天冬酶，抗氧化剂，橄榄油

介绍

钛因其独特的物理化学和生物特性而被广泛应用于医疗器械中，通常用于关节置换术、牙科种植体、脊柱固定装置和心血管支架设备[1]。由于具有耐腐蚀的特点，可作为临床种植材料。

钛在炎症中表现为异物反应。在形成过程中炎症细胞，它表现出正常的恢复。除此之外，钛颗粒细胞还会刺激细胞凋亡[2]。

细胞凋亡不仅在多细胞生物的生长和止血中起着重要的作用，而且在假肢的定位中起着重要的作用。细胞数量的调节主要通过胚胎期的形态发生过程、成熟期的组织更新和免疫应答后三种途径进行。正因为如此，许多疾病都与细胞凋亡有关[3]。正因为如此，许多疾病都与细胞凋亡有关。细胞膜受体主要负责细胞凋亡的生理过程。为了启动诱导凋亡过程的信号复合物，被激活的受体向前半胱天冬酶和适配蛋白发出信号。半胱天酶是一种隐藏于哺乳动物体内的胞质酶，需要激活才能发挥功能。半胱天冬酶可分为起始酶、杀伤酶和斯托金处理酶三大类。启动子被细胞死亡通路的审查者激活并启动caspase级联。执行半胱天冬酶会破坏结构蛋白和维持体内平衡所必需的酶[4]。

组织变性的行为学尚不清楚。因此，活性氧对组织损伤的行为学是一个常见的研究领域[5]。通常情况下，活性氧是在低浓度下产生的，其控制是由抗氧化机制管理的。ROS的过量产生或低排泄会导致严重的代谢异常和氧化应激，从而损害生物大分子[6]。

地衣是一种共生生物，因其治疗多种藻类和真菌兼有的疾病而被广泛使用[7]。松萝longisima本课题组研究了其抗氧化和抗溃疡活性在骨折、腿部病变和病房治疗中的作用[8]。地衣代谢产物中，最常见的是枸杞酸。许多研究已经确定了不同的活动。然而，尚无关于促凋亡活性的研究[9-13]。

除此之外，文献中尚未见有关该地衣细胞凋亡特征的报道。同时，据报道，橄榄油作为地中海饮食的重要组成部分，对自身免疫性、慢性和急性炎症性疾病等多种疾病具有保护作用[14]。Odabasoglu等人显示的usic酸与橄榄油的促凋亡作用目前尚未见报道[15]。本研究旨在评价ti植入兔周围组织中一些凋亡参数和一些生化参数的影响。

材料与方法

植物材料

它是从土耳其的吉雷松地区(安纳托利亚北部)收集的。美国对由Ali Aslan博士鉴定，保存在埃尔祖鲁姆(土耳其)阿塔图尔克大学Kazim Karabekir教育学院的植物标本室。

一般分析程序

实验中使用的化学物质由Sigma chemicals提供。细胞死亡检测试剂盒购自Roche Applied Science (Penzberg, Germany)。橄榄油获得零售市场(Ulker A.S.-Bizim，土耳其)。硅胶60(70-230目)进行结肠层析(CC)，硅胶60f254包覆铝板(Merck)进行薄层色谱(TLC)。

在254 nm紫外波段可见薄层色谱斑点。用岛津FT-IR 8000分光光度计记录KBr颗粒的红外光谱。用瓦里安光谱仪在400 MHz下进行1H和100MHz下进行13C (δ)的核磁共振(NMR)谱。采用四甲基硅烷(TMS)作为内标。在热谱- he - λ ios β分光光度计上记录了枸橼酸的紫外可见光谱和生化分析。熔点在Buchi 510熔点仪上测定，未校正。

地衣样品的提取及尿酸的分离

松萝对(100 g)用150 ml乙醚提取。得到的提取液在4℃下保存24 h沉淀UA。UA沉淀经柱层析后，得到840mg的材料。通过紫外、红外、1h NMR和13c NMR等方法对其结构进行了鉴定[16]。

动物

18只新西兰兔，体重3600-4000克，在实验前保持相同条件[17]。

植入物

将Ti6Al4V种植盘切成圆柱形。生产的棒材直径为10毫米，厚度为1毫米。它们被消毒了。

兔钛植入

这些兔子被分成六个不同的组;

-健康组

-仅ti植入组

-口服橄榄油组

-局部植入和局部管理橄榄油加usnic酸组

-口服橄榄油加枸杞酸组

Ti6Al4V植入物被放置在兔子的腿上。在接下来的21天里，每3天给一次橄榄油和枸杞酸。其他组作为健康对照。给药后，用100 mg / kg硫喷妥钠处死。植入物周围的组织用环钻小心地除去。取部分组织用生理水洗涤，-80℃保存，用于生化分析。而其他组织含% 10福尔马林进行组织病理学检查。

植入物周围组织细胞凋亡的定量分析

采用TUNEL法对植入ti的兔股骨进行TUNEL试验。使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche Applied Science, Penzberg, Germany)定量细胞的相对数量。光镜下凋亡细胞计数(Olympus BH-40)。结果用凋亡指数表示，定义为(TUNEL−阳性细胞数/细胞数计数)×100。

组织生化调查

检测-80℃下组织中SOD、iNOS、MPO、cas2、cas3、cas8、cas9酶活性及GSH含量。根据文献进行测量。

超氧化物歧化酶活性

SOD活性测定参照Sun et al.(1988)[18]。在SOD存在下，通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生超氧化物自由基。所形成的化合物与NTB形成甲氧基甲酸染料。所得化合物的活性在560nm处测量，并以毫摩尔每分钟每毫克组织(mmol/min/mg组织)表示。

谷胱甘肽(GSH)测定

根据Sedlak和Lindsay(1968)的方法测定组织中谷胱甘肽的含量，并稍作修改[19]。

对大鼠胃组织进行称重。在2 ml含有20 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的50 mM Tris-HCl缓冲液中均质。匀浆在4℃下以4200 rpm离心40 min。用上清液中的5,5′-二硫代比斯-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定谷胱甘肽的量。在412 nm处测定吸光度。植入物周围组织中谷胱甘肽水平的结果以纳米摩尔/毫克组织(nmol/mg组织)表示。

髓过氧化物酶(MPO)活性

MPO活性的测定采用Bradley等(1982)[20]改进的方法。匀浆在1500 g下在4°C下离心10 min。将100 μl上清液加入1.9 ml 10 mmol/l磷酸盐缓冲液(pH 6.0)和1 ml含0.0005% w/v过氧化氢的1.5 mol/l o-二苯胺盐酸中，测定MPO活性。在紫外可见分光光度计上记录每个样品在450nm处的吸光度。组织中MPO活性以微摩尔每分钟每毫克组织(μmol/min/mg组织)表示。

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性

如前所述，用分光光度法测定组织中iNOS的活性。总NOS测定，培养液含1.6 μM氧化血红蛋白，200 μM氯化钙₂， 1 mM MgCl₂100 μM l -精氨酸，100 μM NADPH, 40 mM磷酸钾pH 7.2, 1 mM ng -硝基- l -精氨酸，10% v/v组织提取物加50 mM l -缬氨酸抑制精氨酸酶[21]。在不含ng -硝基- l -精氨酸的培养液中加入1 mM乙二醇醚二胺四乙酸进行cNOS检测。氧合血红蛋白氧化被证实是由NO合成引起的。周围组织iNOS活性以纳摩尔每分钟每毫克组织表示(nmol/min/mg组织)。iNOS活性由NOS总活性减去cNOS活性计算。

植入物周围组织中半胱天冬酶蛋白酶的活性

用比色法测定半胱天冬酶活性。用ultra-turrax匀浆机对种植体周围组织进行匀浆[22]。匀浆后的组织孵育1小时。将组织离心，然后准备上清。上清液与酶底物孵育。分别测定caspase 2、3、8和9。

利用热谱仪(Thermo spectronic - he - λ ios β)在412 nm处的吸光度变化测定释放的pNA。活化率计算公式如下:[(absor光度/412 nm)×100]。

统计分析

酶活性、细胞凋亡和其他测量得分的数据使用SPSS 11.0软件进行单向方差分析(ANOVA)，存在阴性对照和阳性对照。采用Duncan选项比较各组间的差异，P<0.05为显著性。

结果

TUNEL法评价细胞凋亡

用隧道涂层对家兔的凋亡细胞进行染色(图2)。植入物放置后，除健康组外，各组均口服橄榄油。(图2D)和局部(图2C)，在治疗组中观察到明显的诱导。相反，在口服(图2B)和局部(图2A)给药橄榄油加usic酸后，ti植入组(图2E)和橄榄油加ti植入组(图2C和D)的凋亡细胞最多。表1为细胞凋亡结果汇总。

图1所示。枸杞酸的结构

图2。口服和局部给药橄榄油和橄榄油加枸橼酸对ti诱导家兔周围组织凋亡的影响。各实验组均取给药后周围组织切片。TUNEL法检测炎性细胞凋亡，TUNEL阳性细胞细胞核呈棕色。（一个):局部注入橄榄油加枸橼酸组，(B):滴注和口服橄榄油加枸杞酸组，(C):就地注射橄榄油组，(D);口服橄榄油组，(E):仅ti植入组，(F):健康组

生化分析结果

橄榄油和枸杞酸对钛植入家兔半胱天冬酶组织活性的影响:获得的数据显示，植入后组织中caspase活性升高(P<0.05)(表2、图3)。植入后局部应用usnic酸加橄榄油时，caspase活性升高最有效。

图3。橄榄油(OO)和usnic酸(UA)对钛(Ti)植入兔种植体周围组织中caspase蛋白酶(caspase-2、-3、-8和-9)活性变化的影响数据用控制倍数表示

橄榄油和茴香酸对钛植入家兔组织抗炎参数(MPO和iNOS)活性的影响:与健康组相比，ti植入显著降低了MPO和iNOS活性，并显著降低了橄榄油和茴香酸的给药量(P<0.05)，见图4和图5。局部给药组比口服给药组更有效地减少。然而，橄榄油加usic酸联合给药更有效地降低了ti植入兔的iNOS和MPO活性(P<0.05)，但局部给药橄榄油加usic酸组的iNOS和MPO活性没有降低(P<0.05)。我们还发现橄榄油通过局部给药比口服给药更有效。相比之下，橄榄油加usic酸通过局部途径比口服途径更有效地激活iNOS和MPO活性。

图4。usic acid (UA)和橄榄油(OO)对钛(Ti)植入兔种植体周围组织髓过氧化物酶(MPO)活性变化的影响同列同字母的平均值与Duncan检验无显著差异(=0.05)。结果为三次测量的平均值±标准差

图5。usic acid (UA)和橄榄油(OO)对钛(Ti)植入家兔种植体周围组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性变化的影响同列同字母的平均值与Duncan检验无显著差异(=0.05)。结果为三次测量的平均值±标准差

橄榄油和枸杞酸对钛植入兔抗氧化指标(SOD和GSH)组织活性的影响:与健康组相比，植入组的GSH和SOD活性显著降低(P<0.05)(图6、7)。与Ti植入组相比，橄榄油和橄榄油加usus酸给药组的SOD活性和GSH水平均升高(P<0.05)。局部给药橄榄油和橄榄油加枸杞酸比口服给药更有效地提高SOD活性和GSH水平。当我们评估整体结果时，我们发现提高SOD活性和GSH水平最有效的处理(图6和7)是局部处理橄榄油加usnic酸，另一方面，局部处理橄榄油加usnic酸有增加MPO和iNOS活性的效果。

图6。usic acid (UA)和橄榄油(OO)对钛(Ti)植入家兔种植体周围组织超氧化物歧化酶(SOD)活性变化的影响同列同字母的平均值与Duncan检验无显著差异(=0.05)。结果为三次测量的平均值±标准差

图7。usic acid (UA)和橄榄油(OO)对钛(Ti)植入家兔种植体周围组织总谷胱甘肽(GSH)水平变化的影响同列同字母的平均值与Duncan检验无显著差异(=0.05)。结果为三次测量的平均值±标准差

讨论

在炎症后阶段，钛合金启动了炎症过程。该过程因组织损伤、器官功能障碍和细胞凋亡而终止。但周围组织的凋亡机制尚不清楚。该机制与植入钛合金的组织具有相似的特点。在以往的研究中，发现细胞凋亡发生在成骨细胞周围的组织中。在本研究中，口服和局部同时给药OO和UA均可增加周围组织的凋亡[3]。文献报道，橄榄油和一些地衣物种具有促细胞凋亡的特性。根据我们的观察数据，可以认为OO和UA可能在兔植入周周围组织中发挥了重要作用[23,24]。据认为，天然化合物引发的细胞凋亡可能对几种癌症具有保护作用[25]。

caspase的激活在细胞凋亡过程中起重要作用[15]。这种酶通过凋亡通路的传感器被激活，以启动caspase级联。刽子手半胱天冬酶有两种不同的生理凋亡过程。激活后，caspase级联即可启动。在细胞凋亡中，刽子手以两种方式被激活。它们在第一途径受到死亡受体(FAS、CD95、TNF家族、APO 1.vs)的刺激。被激活的受体还包括适配器蛋白和激活caspase级联的caspase[3]。它们通过与p53、Bax、sitocrom c、JNK、Bid、NO•和ONOO•等多种事件相互作用而受到刺激[26]。

在本研究中，caspase 2、3、8和9在抗移植兔的周围组织中被激活。结果表明，同时给药OO和UA显著增加了局部和口服应用的激活。根据这些结果，可以认为UA和OO具有促凋亡的特性。

研究表明，Ti通过激活caspase酶诱导细胞凋亡[27]。顺便说一下，文献中有几项研究表明地衣代谢物也能诱导线粒体凋亡[15,28]。然而，关于这一问题的数据并不充分。文献中关于地衣次生代谢物的信息有限[23,29]。地衣代谢物对人黑色素瘤细胞、l1210处理细胞、A2780和HT-29癌细胞系大鼠肝细胞、前列腺癌细胞、人肺癌A549细胞、人结肠癌LS174细胞和黑色素瘤FemX细胞、乳腺癌细胞系T-47D和胰腺癌细胞系Capan-2的影响发表了多篇论文。(36)所得结果与近期研究一致[27,30-36]。

本研究旨在揭示INOS、MPO和SOD酶、GSH水平对凋亡和caspase酶活化的影响。通过iNOS酶生成NO是细胞凋亡最重要的刺激物之一[14]。一氧化氮(NO•)可通过以下四种途径参与细胞凋亡和caspase活化:

(1) TNF-α刺激时NO•水平升高[15]。

一氧化氮水平的增加抑制了JNK的形成。在iNOS活性降低的情况下，刺激caspase 9、TNF-α、JNK和Bax可增加细胞凋亡[37,38]

(2)一氧化氮水平升高可能通过抑制caspase抑制细胞凋亡;[39]

(3)增加的一氧化氮渗入细胞核。p53基因通过催化反应激活。激活基因打开Bax→细胞色素c→caspase 9通路，激活CD95和PIDD (RAIDD);[40]

(4) NO•的增加可以通过阻止细胞色素c和胞质头部休克蛋白(HSP， -70和-90)的凋亡形成来减少细胞凋亡。[41]

在目前的研究中，确定口服给药比局部给药更明显地抑制inos。因此，这种抑制可能是由上述四种不同的机制引起的。

说明葡萄酸和橄榄油可能通过TNF-α诱导JNK→Bax→细胞色素c→caspase 9通路，使inos诱导的NO•增加，最终caspase 9被激活。结果与文献一致，支持细胞凋亡是一个重要的调节因子[15,37]。

也就是说，在植入钛或细胞凋亡的组织中，iNOS活性显著升高。在最近的研究中，监测到橄榄油和一些地衣物种可能会降低iNOS活性[15]。MPO酶产生•NO₂从H₂O₂也没有₂。NO的产生₂由JNK促进、P53基因刺激和caspase 9激活提供[15]。在本研究中，口服OO和UA可显著降低MPO活性。结果表明，NO₂可能在这些情况下产生。这两种情况都会增加细胞凋亡。因此，UA和OO通过iNOS参与NO的产生，并通过MPO激活Caspase 2、8和9。这些酶的激活促进了caspase 3,6和7的合成[42]。一些研究表明，口服OO和一些地衣物种会降低MPO活性。

SOD活性和GSH水平的降低不仅会引起超氧化物和其他氧自由基的积累，还会引起细胞损伤[37,43]。这种情况与线粒体凋亡有关。线粒体中H2O2的增加在凋亡过程中起重要作用[15]。H的增加₂O₂水平刺激细胞色素C从线粒体到细胞质的分泌。Cit C促进caspase 9和apaf1, apaf1负责从procaspase 3产生活化的caspase 3。然后，Caspase 3诱导Caspase 6和Caspase 7导致细胞凋亡[15,37]。实验结果可以支持这一假设。SOD活性和GSH水平的降低可能是永久性钛诱导的氧化应激所致。在目前的工作中，报道了葡萄酸和橄榄油增加了SOD活性和GSH水平。H2O2浓度升高与SOD活性同时升高导致线粒体细胞色素c释放增加，并通过激活caspase 9诱导细胞凋亡。已有研究表明，在不同条件下，无粒径二氧化钛可降低SOD活性[44,45]。一些研究报道，谷胱甘肽的消耗可能是由于细胞凋亡和组织损伤[15]。经测定，在某些疾病中，口服橄榄油和某些地衣可提高SOD活性和GSH水平[9,14,15,46]。 These findings are parallel to the present study. The current study is the first findings of titanium-induced rabbits. The proapoptotic effect of olive oil and usnic acid was demonstrated.The apoptosis plays an important role in homeostasis in multicellular organisms. The disruption of the process can be devastating in apoptosis because the cell number is regulated in the embryo. unspecified apoptosis may result from many different conditions such as diabetes, systemic lupus erythematosus, cancer, mononucleosis, AIDS, Alzheimer's disease, confirmed hepatitis, Parkinson's disease and cerebral or cardiac infarction. In addition, the results of the study indicate that it can be used as an agent in disorders related to cancer. However, it is not tried in other cancer models, usnic acid belongs to a detailed research. In conclusion, we have demonstrated that both orally and locally administered olive oil and usnic acid exerted pro-apoptotic effects on surrounding tissues of titanium-implanted rabbits. As a result, the proapoptotic effects of usnic acid and olive oil, which are applied both orally and orally, have been demonstrated. therefore, we can be used as an agent in the treatment of various diseases.

致谢

这项研究是在阿塔图尔克大学(25240 Erzurum/土耳其)药学院生物化学和药理学实验室、医学院药理学-病理学-组织学-胚胎学实验室和实验医学应用和研究中心实验室进行的。

我们感谢Halis Suleyman博士出色的技术支持，以及Cavit Kazaz博士在分子表征方面的宝贵帮助。我们也感谢阿塔图尔克大学科研单位对项目的支持。

作者的贡献

F.O.和O.S.Y.进行了项目规划、实验设计、实验工作和数据分析。O.S.Y和H.A.进行了植入手术的实验。f.a.、o.a.b.、m.h.、Y.B.和A.C.进行了分离、表征、生化分析和数据分析的实验。A.A.进行植物收集和系统研究。ba负责所有植入手术。F.E和I.C进行组织学和组织病理分析实验。z.h和E.C.进行药理学实验。F.O.监督了这项研究，致力于撰写手稿的通信，并与F.A.和O.A.共同撰写了论文

利益冲突

作者与药品、实验室用品和/或医疗设备制造商或医疗相关服务的商业提供商没有商业利益、经济利益和/或其他关系。

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