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摘要

目的:肿瘤干细胞(CSCs)表现出过度的迁移和侵袭潜能。褪黑素可能抑制与肿瘤干细胞自我更新、活力、侵袭性、肿瘤生长和治疗耐药性相关的多种关键信号。与光子照射相比，碳离子照射在非茎样和茎样肿瘤细胞中都是一种很有前途的治疗方式。全面了解与CSCs侵袭特性相关的机制和分子途径对于开发针对CSCs的新型癌症治疗方案至关重要。

材料和方法:使用以下搜索词对现有文献进行了系统回顾:“褪黑素”、“x射线照射”、“带电粒子照射”、“碳离子照射”、“癌症干细胞”、“肿瘤起始细胞”和“癌症干细胞样细胞”。搜索使用PubMed，时间跨度从2000年1月到2016年12月。

结果:收集的数据包括褪黑素和碳离子照射对肿瘤干细胞的影响。褪黑素对肿瘤干细胞的影响包括“褪黑素通过AKT-EZH2-STAT3信号轴抑制脑肿瘤干细胞的致瘤性”，“褪黑素诱导的ABCG2/BCRP启动子甲基化克服脑肿瘤干细胞的多药耐药性”，“褪黑素诱导的脑肿瘤干细胞细胞毒性中自噬的参与”，“褪黑素抑制乳腺癌干细胞中OCT4基因上雌激素受体与雌激素反应元件位点的结合”和“褪黑素对上皮间充质转化标志物和乳腺癌干细胞侵袭性的影响”。碳离子照射对肿瘤干细胞的影响包括“碳离子照射有效根除脑肿瘤干细胞”、“碳离子照射抵消癌症干细胞在头颈部鳞状细胞癌中的迁移和侵袭过程”、“碳离子束联合顺铂有效破坏三阴性乳腺癌干细胞”、“碳离子束对假定的结肠癌干细胞的影响及其与x射线的比较”和“碳离子束和x射线对克隆人胰腺癌干细胞样细胞的生存和DNA修复的不同影响”。

结论:癌症干细胞具有自我更新和多能性，在肿瘤内产生所有细胞，并负责肿瘤生长、治疗耐药性和转移。褪黑素减弱AKT激活、EZH2 S21磷酸化、EZH2- stat3相互作用和改变组蛋白修饰以减少脑肿瘤干细胞(BTSC)的肿瘤起始和增殖。褪黑素通过诱导ABCG2/BCRP转运蛋白启动子甲基化来调节其表达和功能，从而提高化疗药物的疗效，靶向肿瘤体积和BTSCs。褪黑素治疗诱导细胞死亡，具有自噬的超微结构特征。乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells, BCSCs)对褪黑素的响应是通过降低乳腺癌乳腺微囊的活力和侵袭性，以及调节BCSCs中与上皮间充质转化相关的OCT4、N-cadherin和vimentin蛋白的表达。碳照射可有效消除脑肿瘤干细胞(BTSC)，相对生物有效性(RBE)在1.87 ~ 3.44之间。碳离子照射可能是一种有前途的治疗方式，因为与光子照射相比，碳离子照射减少了头颈部鳞状细胞癌和癌症干细胞的迁移和侵袭过程。低LET x射线照射可基本根除非茎样肿瘤细胞，从而明显丰富了耐辐射的癌茎样细胞群。相反，碳离子照射可以同时根除非茎样和茎样肿瘤细胞。碳离子照射是一种很有前途的根除假定的结肠癌干细胞样细胞的工具。 Further investigation to elucidate the mechanisms and molecular pathways involved in cancer stem cells particularly associated with melatonin and carbon ion irradiation certainly is warranted.

关键字

褪黑素、x射线照射、带电粒子照射、碳离子照射、癌症干细胞、肿瘤起始细胞、癌症干细胞样细胞

简介

癌症干细胞(CSCs)，也称为肿瘤启动细胞，包括肿瘤块的一个独特部分，具有自我更新和多能性，在肿瘤内产生所有细胞;这些特化细胞负责肿瘤复发、化疗和放疗的抵抗以及转移[1-4]。癌症干细胞还负责肿瘤细胞异质性的发展，这往往与常规疗法的失败有关。因此，靶向CSCs对于开发创新疗法以对抗癌症复发和耐药[6]的出现至关重要。

褪黑素(n -乙酰-5-甲氧基色胺)是松果体和许多其他组织合成的一种吲哚化合物，是一种重要的肿瘤抑制剂[7-14]。由于该分子具有促凋亡、抗增殖、抗细胞分化和抗血管生成的作用，在各种类型的癌症中发挥抗癌作用[15,16]。大量研究表明，褪黑素抑制与脑肿瘤干细胞自我更新、生存能力、侵袭性、肿瘤生长和治疗耐药性相关的多个关键信号[17-19]。褪黑素不仅对肿瘤总质量具有抗肿瘤作用，而且对CSCs[21]亚群具有抗肿瘤作用。放射治疗是一种重要的癌症治疗方式。x射线由光子组成，通常用于放射治疗。x射线被定义为低LET(线性能量转移)辐射，沿其轨迹[22]只产生偶然的电离。使用光子照射的放射治疗失败通常与转移有关。质子、碳离子等高let带电粒子在癌症治疗中的应用越来越多[24-26]。碳离子沿其轨迹产生大量电离，并诱导不可修复的聚集DNA损伤。 Carbon ion irradiation is more potent in the induction of cytogenetic damage and cytotoxicity of irradiated cells than low-LET X-rays [26,27]. Several recent studies indicate that carbon ion irradiation may be a promising therapeutic modality because of complex DNA damage, increased apoptosis, and counteractive actions on migration and invasive processes in both parental cells of head and neck squamous cell carcinoma and CSCs that it displays. This distinguishes it from photon irradiation [28-32].

全面了解与CSCs侵袭特性相关的机制和分子途径对于开发针对CSCs的新型癌症治疗方案至关重要。

材料与方法

文献检索策略

使用以下搜索词对现有文献进行了系统回顾:“褪黑素”、“x射线照射”、“带电粒子照射”、“碳离子照射”、“癌症干细胞”、“肿瘤起始细胞”和“癌症干细胞样细胞”。搜索使用PubMed，时间跨度从2000年1月到2016年12月。

纳入和排除标准

我们确定了包含褪黑素和碳离子照射对肿瘤干细胞影响的报告。以英文以外的语言发表的报告、仅以摘要形式发表的报告、与肿瘤干细胞无关的报告、重复文章和细节不充分的报告被排除。所有的标题和摘要都经过筛选，以评估它们是否符合纳入的条件。然后检查所有符合条件的研究的摘要和全文，并对数据进行评估。

结果

文献检索结果

这次搜索确定了109篇可能符合条件的文章。应用排除标准后，只有10例符合标准，因此进行评估。收集的数据包括褪黑素和碳离子照射对肿瘤干细胞的影响。褪黑素对肿瘤干细胞的影响包括“褪黑素通过AKT-EZH2-STAT3信号轴抑制脑肿瘤干细胞的致瘤性”，“褪黑素诱导的ABCG2/BCRP启动子甲基化克服脑肿瘤干细胞的多药耐药性”，“褪黑素诱导的脑肿瘤干细胞细胞毒性中自噬的参与”，“褪黑素抑制乳腺癌干细胞中OCT4基因上雌激素受体与雌激素反应元件位点的结合”和“褪黑素对上皮间充质转化标志物和乳腺癌干细胞侵袭性的影响”。碳离子照射对肿瘤干细胞的影响包括“碳离子照射有效根除脑肿瘤干细胞”、“碳离子照射抵消癌症干细胞在头颈部鳞状细胞癌中的迁移和侵袭过程”、“碳离子束联合顺铂有效破坏三阴性乳腺癌干细胞”、“碳离子束对假定的结肠癌干细胞的影响及其与x射线的比较”和“碳离子束和x射线对克隆人胰腺癌干细胞样细胞的生存和DNA修复的不同影响”。

褪黑素对肿瘤干细胞的影响

褪黑素通过AKT-EZH2-STAT3信号轴抑制脑肿瘤干细胞的致瘤性:多项研究表明，具有自我更新和肿瘤增殖能力的胶质母细胞瘤干样细胞(GSCs)或脑肿瘤干细胞在维持肿瘤生长、治疗耐药和肿瘤复发中发挥着重要作用[33-35]。多梳族蛋白与各种类型癌症[36]的发展有关。表观遗传扰动可能是肿瘤抑制基因转录失调的基础。这种错误调控的结果与癌症干细胞的形成有关，癌症干细胞通过增加自我更新和不完全细胞分化的结合产生肿瘤(36)。多梳蛋白包含至少两种不同的复合物，多梳抑制复合物1和2 (PRC1和PRC2)[36]。Polycomb repression complex 2 (PRC2)通过在组蛋白H3的赖氨酸27上放置甲基化标记，在转录沉默中发挥主要作用[37,38]。PRC2功能失调与某些恶性肿瘤和不良预后相关[37,38]。zeste同源物2增强子(EZH2)是PRC2的催化亚基。因此，EZH2被认为是药物干预的重要靶点[37,38]。EZH2通过甲基化赖氨酸27上的组蛋白H3参与抑制基因表达。 EZH2 overexpression is associated with tumorigenesis and related to poor prognosis in various tumor types [38-40]. AKT is an oncogenic protein kinase that plays a critical role in cell transformation, cancer cell proliferation, invasion, migration, and angiogenesis of tumor tissues [41-43]. Phosphoinositide 3- kinase (PI3K)/AKT signaling is frequently overexpressesd in glioblastoma multiforme (GBM) specimens [44-48].

Chen及其同事利用从GBM患者手术标本中分离出的胶质母细胞瘤干样细胞(GSCs)来分析褪黑素在GSC生物学[17]中的作用和潜在机制。他们注意到，1 mol/L的褪黑素改变了神经球的形状。他们评估了褪黑素治疗的效果在体外发现GSCs的增殖率适度降低，BrdU掺入减少了约25%。利用克隆原试验来评估褪黑素治疗对GSC自我更新的影响，神经球用1 mol/L褪黑素治疗5天;然后将球破坏，并在CSC培养基中镀成单细胞悬浮液，以评估成球能力。褪黑素治疗使所有GBM样本的克隆原性指数降低了75%。

Western blotting显示褪黑素诱导癌症干细胞标志物表达减少。经褪黑素膜受体拮抗剂luzindole预处理后，用褪黑素(1 mol/L)处理GSCs 5 d。Western blot检测CD133表达。这一分析揭示了褪黑素对CD133的下调是通过阻断褪黑素膜受体而中断的。这些数据进一步表明褪黑素对GSC自我更新和肿瘤启动能力[17]有抑制作用。

EZH2-STAT3相互作用在GSCs中明显，对GSC的克隆生长是必要的[49-51]。进行免疫共沉淀实验，以确定褪黑素治疗对GSCs中EZH2-STAT3相互作用的影响。未接受褪黑素治疗的GSCs中EZH2-STAT3共沉淀丰富。相比之下，在褪黑素治疗[17]后从GSCs分离出的裂解物中几乎检测不到。

褪黑素抑制GSCs EZH2 S21磷酸化(pS21)。测量褪黑素处理的GSCs中H3K27me3水平，以确定褪黑素诱导的EZH2 pS21对组蛋白H3甲基化状态的影响。褪黑素治疗后H3K27me3明显增加。

STAT3的激活由EZH2 S21的磷酸化和随后的EZH2对STAT3的甲基化介导[52,53]。评估褪黑素在STAT3甲基化中的作用及其对GSCs的影响。褪黑素治疗显著抑制STAT3甲基化在所有三个GSCs[17]中发现。与此同时，酪氨酸磷酸化STAT3 (pY-STAT3)浓度与未接受褪黑素治疗的GSCs检测到的浓度相比降低了30%。荧光素酶报告实验表明，褪黑素治疗[17]基本上抑制了STAT3的转录活性。

简而言之，AKT过表达明显增加EZH2 S21磷酸化水平、EZH2-STAT3相互作用和STAT3活性，但降低H3K27me3水平[17]。数据显示，褪黑素通过改变GSC生物学和抑制GSC增殖直接靶向胶质瘤肿瘤细胞。AKT-STAT3-EZH2信号通路和EZH2磷酸化在GSC的生长中发挥重要作用。褪黑素治疗减弱了AKT的激活，EZH2 S21磷酸化，EZH2- stat3的相互作用，并改变组蛋白修饰以抑制肿瘤的发生和传播。这些结果表明褪黑素减弱了与GSC自我更新和生存相关的多个关键信号，并进一步表明褪黑素是治疗GBM[17]的一种令人鼓舞的治疗剂。

褪黑激素诱导的ABCG2/BCRP启动子甲基化克服脑肿瘤干细胞的多药耐药:最近的研究表明，恶性胶质母细胞瘤中的脑肿瘤干细胞过度表达三磷酸腺苷结合盒(ABC)家族转运蛋白，导致多药耐药和肿瘤复发[54-56]。因此，针对肿瘤体积和脑肿瘤干细胞(BTSC)间隔的治疗策略对于带来稳定和持久的缓解[18]是至关重要的。

马丁和同事们观察到褪黑素显著增加了替莫唑胺、阿霉素或米托蒽醌[18]的抗癌活性。他们的研究表明，褪黑素和化疗药物的联合孵育在三种BTSC系(NSC23, NSC7-2和NSC11)中产生了协同抑制作用。BTSCs中ABCG2/BCRP和ABCB1/MDR1的mRNA水平远高于胶质母细胞瘤细胞系[18]。这一发现与BTSCs对替莫唑胺、阿霉素和米托蒽醌的较高耐药性一致。他们发现褪黑素导致BTSCs中ABCG2/BCRP的mRNA水平显著降低。这些结果表明，褪黑素可能通过下调ABCG2/BCRP的表达，从而抑制BTSCs的多药耐药，从而增加细胞内药物积累，进而增强细胞死亡[18]。

Martin和同事观察到，从患者身上分离出来的胶质母细胞瘤样本中ABCG2启动子的甲基化水平低于正常大脑。用褪黑素治疗BTSCs可显著降低未甲基化启动子水平，并伴随高甲基化和部分甲基化水平的增加。甲基化特异性PCR (MSP)分析验证了褪黑素[18]治疗后BTSCs中ABCG2/BCRP启动子的甲基化。因此，褪黑素可能通过诱导ABCG2/BCRP启动子甲基化来降低转运蛋白表达和BTSC对化疗药物的耐药性。

这些作者还报告说，褪黑素不仅在BTSCs中增强化疗诱导的细胞死亡，而且在人类恶性胶质母细胞瘤细胞系(A172)中也能增强。5-氮胞苷(AZA)预孵育可抑制褪黑素对启动子甲基化的提升。这一发现提示褪黑素[18]对ABCG2/BCRP表达和功能的表观遗传调控。

简而言之，褪黑素通过诱导ABCG2/BCRP转运体启动子[18]的甲基化来调节其表达和功能，从而提高化疗药物的疗效，既针对大块肿瘤，也针对BTSCs。数据提示ABCG2/BCRP功能下调可能与褪黑素和化疗药物的协同作用有关。褪黑素可能是一个有价值的候选人，以抵消多药耐药治疗胶质母细胞瘤，从而提高当代治疗的疗效。

自噬参与褪黑激素诱导的脑肿瘤干细胞的细胞毒性:胶质瘤起始细胞(GIC)或脑肿瘤干细胞对现代治疗方式具有耐药性，可能是肿瘤频繁复发的原因[33,57]。自噬是细胞自食的过程，被认为是一种溶酶体降解途径，在肿瘤发生中起着动态调节作用[58,59]。

在Martin及其同事进行的研究中，从人胶质母细胞瘤术后标本[21]分离的细胞中建立了神经球形培养。神经球培养显示GIC表型(自我更新、增殖、干细胞标志物表达、多能性和形成肿瘤的能力)在活的有机体内)．为了研究褪黑素对胶质母细胞瘤患者GIC细胞增殖的影响，我们用不同浓度的褪黑素(1 ~ 1000 μM)处理了三个GIC系(GIC- a、GIC- b和GIC- c)。只有最高浓度(1 mM)抑制了3个GIC株系[21]的生长。

为了评估褪黑素对自我更新的影响，进行了[21]限制性稀释试验。褪黑素减少游离后次生球的形成。在褪黑激素治疗组中，至少需要一倍的细胞数量才能产生第二个神经球。褪黑素也降低了自我更新能力在克隆原试验的三个GIC系测试。褪黑素治疗降低了三个测试的GIC系中转录因子Sox2、Oct3/4和Nanog等干细胞标志物的mRNA表达水平，这意味着褪黑素在调节GIC[21]中干细胞特性中的作用。

马丁和同事们评估了褪黑素对GICs亚群生存能力的影响。他们发现褪黑素在治疗48小时后诱导了乳酸脱氢酶(LDH)释放的时间依赖性增加，这表明了细胞死亡的诱导。褪黑素对正常人类神经细胞系(hNSC.100)活力的影响也得到了同样的评估。在任何时间点都没有发现LDH释放的显著变化，这表明褪黑素的抗癌作用仅限于癌症来源的干细胞[21]。

这些作者进一步检查了褪黑素治疗后GIC的超微结构特征，以确定褪黑素对这些细胞的影响性质。褪黑素处理的细胞在治疗后24小时开始逐渐积累自噬小泡。空泡包住了细胞质内容物，且随着处理时间的增加而增多。因此，在褪黑素治疗后的后期，液泡占据了细胞质的主要部分，并且发现了与极度液泡化的细胞质和细胞结构相关的细胞膜的巨大破坏。Western blot也验证了褪黑素对GIC自噬的诱导作用。褪黑素治疗增强了微管相关蛋白1A/ 1b轻链3 (LC3 I)向LC3 II的转化，这表明自噬级联的启动和自噬体[21]的形成。

简而言之，马丁及其同事的研究表明，褪黑素治疗减少了GIC增殖，并导致自我更新和克隆生成能力的降低，同时干细胞标记物的表达减少。此外，该研究还表明，褪黑素治疗诱导细胞死亡，具有自噬的超微结构特征。褪黑素不仅对大量肿瘤细胞具有抗肿瘤作用，而且对GIC亚群也具有抗肿瘤作用。因此，这些结果表明褪黑素是一种很有前途的治疗胶质母细胞瘤的药物。

褪黑素抑制雌激素受体与人乳腺癌干细胞OCT4基因上雌激素反应元件的结合:由POU5F1基因编码的转录因子OCT4是癌症干细胞自我更新和维持多能性的关键因素[60-62]。雌二醇(E2)是雌激素受体(ER)阳性乳腺肿瘤的主要生长刺激物[63,64]。双酚A (BPA)是一种具有类似E2生物学功能的环境雌激素。BPA在乳腺癌的发生或发展中发挥作用，并激活促进乳腺癌细胞增殖的基因转录[65,66]。Lopes和同事评估了褪黑素在MCF-7细胞中被肿瘤起始化学物质BPA和E2激活后，对乳腺癌干细胞(BCSC)中OCT4/POU5F1调控的影响。利用细胞悬浮和锚定独立生长两种单独技术，实现乳腺球的三维生长。在三维(3D)模型中的生长提供了一个人工肿瘤环境，其中细胞适当分离，形成与所发现的情况相当的成人组织成分在活的有机体内(67、68)。这两种技术都是为了评估褪黑素对BPA和E2处理的乳腺球的影响。两种技术的结果是相似的。与对照组相比，10 nM E2和10 μM BPA处理可显著增加乳腺微球的数量和大小。相反，与对照组相比，1 mM的褪黑素显著减少了乳房微球的数量和大小。此外，当细胞被E2或BPA刺激并同时使用褪黑素时，乳房微球[20]的数量和大小明显减少。

通过染色质免疫沉淀试验确定褪黑素对雌激素受体与POU5F1基因结合的影响。用10 nM E2或10 μM BPA处理的乳房微球显著增加了ER与OCT4转录位点OCT4-3544中假设的ERE(雌激素反应元件)序列的结合。相反，经10 nM E2或10μ m BPA刺激和1 mM褪黑素处理的细胞显示，ER与OCT4转录位点OCT4-3544中推测的ERE序列的结合显著降低。此外，经E2或BPA处理的乳腺球在OCT4启动子区-1999 kb处略微增强了ER与ERE位点的结合。当使用褪黑素[20]治疗乳房微球时，这种增强作用减弱。

采用实时定量PCR (Quantitative real - time PCR, qPCR)检测褪黑素与E2、BPA处理后小鼠OCT4和ERα基因的表达水平。经E2或BPA处理的细胞表现出OCT4和ERα基因转录水平的增加。在单独使用褪黑素或同时使用E2或BPA[20]处理的细胞中，OCT4和ERα mRNA水平显著降低。

研究人员评估了雌激素、BPA和褪黑素对这些细胞中ER和OCT4蛋白水平的影响。E2和BPA显著刺激ERα蛋白水平。在E2或BPA处理的细胞中，OCT4蛋白水平也有所提高。褪黑素处理的所有细胞中ERα蛋白水平都有所下降，但减少的程度与mRNA水平的变化并不精确相关，这表明额外的调节水平可能会影响ERα水平。此外，褪黑素降低了OCT4蛋白的水平。仅观察到OCT4转录水平的微小变化，这意味着OCT4蛋白水平的调节可能在翻译和/或翻译后水平[20]上被调节。

总之，Lopes及其同事的研究表明，褪黑素抑制了E2和BPA治疗对乳腺球生长的影响，同时抑制了ERα和干细胞标志物OCT4的表达。褪黑素治疗可有效抑制BCSC增殖，并对ER通路产生影响，提示其可作为乳腺癌的一种治疗方法。

褪黑素对上皮间充质转化标志物及乳腺癌干细胞侵袭性的影响:上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是使癌症干细胞具有侵袭性和转移性的过程[69-71]。这一过程由生长因子和转录因子活性介导，导致上皮细胞细胞间连接结构丧失，获得间充质形态，顶端-基底细胞极性丧失，迁移/侵袭能力丧失[72-74]。各种研究也表明，EMT参与了细胞可塑性，即非干细胞获得干细胞特征的过程[75-77]。EMT的主要分子特征包括上皮标记物E-cadherin的缺失以及间充质标记物N-cadherin和vimentin的过表达[78,79]。多项研究也表明褪黑素具有抗侵袭性和抗转移作用，涉及包括EMT在内的多个细胞过程[80-82]。

多项研究证实了犬和人乳腺癌细胞系中存在干细胞[83-89]。Dontu及其同事的研究表明，肿瘤细胞的干性是可以评估的在体外通过它们产生乳腺球的能力[90]。犬和人乳腺癌细胞容易产生乳腺球，包括CD44+/CD24low/-细胞，这些细胞验证了癌症干细胞表型[90]。CD44+/CD24low/-表面表型的乳腺癌细胞具有多能性和侵袭能力[19]的肿瘤起始特征。Ponti等观察到，发育成球形的乳腺癌细胞系也具有CD44+/CD24low/-表型，并表达转录因子OCT4[91]。OCT4的表达在癌症发生中起着重要作用，并提供了癌细胞获得或维持治疗耐药表型的可能机制[92,93]。该基因的过表达与结直肠癌、肺癌、胶质瘤等多种癌症的转移和不良预后有关[94-99]。

在Goncalves及其同事的研究中，在MammoCultTM培养基(StemCell Technologies)中，用犬乳腺癌细胞系CMT-U229和人乳腺癌细胞系MCF-7生成了乳房微球。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑)试验评估1 mM褪黑素处理24小时后存活细胞的数量。与对照组[19]相比，在1mM褪黑素治疗24小时后，两种细胞系的乳腺球细胞活力均显著降低。为了评估褪黑素对来自两种细胞系的乳腺癌干细胞的影响，我们估计了乳腺癌干细胞标记物OCT4、上皮标记物e -钙粘蛋白、间充质标记物n -钙粘蛋白和vimentin的蛋白表达。在使用1 mM褪黑素处理的CMT-U229细胞中，与对照组相比，褪黑素处理后OCT4蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著增强。与对照组相比，褪黑素处理的细胞中n -钙粘蛋白和波形蛋白的表达显著降低。对于MCF-7细胞，与对照组相比，褪黑素处理的细胞中OCT4蛋白表达也降低了(p = 0.0001)，褪黑素处理后E-cadherin蛋白表达增加(p = 0.0001)。褪黑素处理细胞中N-cadherin和vimentin蛋白低表达。在Boyden室进行细胞迁移和侵袭评估。用1 mM褪黑素处理CMT-U229和MCF-7细胞24小时。 Melatonin reduced migration and invasion of CMT-U229 and MCF-7 mammospheres as compared with the control groups (p = 0.0017, p = 0.0377, respectively) [19]. The results collectively reveal that canine and human breast cancer stem cells are responsive to melatonin treatment with a reduction of viability and the invasiveness of breast cancer mammospheres as well as the expression of stem cell and EMT markers, indicating the potential therapeutic role of melatonin in the treatment of breast cancer.

碳离子照射对肿瘤干细胞的影响

碳离子照射可有效根除脑肿瘤干细胞:细胞在辐射中存活和产生菌落的能力与肿瘤辐射敏感性有关。克隆生存分析评估了放射敏感性，并建立了治疗结果的预测模型[100101]。在Chiblak及其同事的研究中，从6名同意的胶质母细胞瘤患者[28]的肿瘤标本中建立了人类原发性胶质瘤干细胞(GSC或脑瘤干细胞)球形培养。人U87MG被用作常规的胶质母细胞瘤放射抗细胞系。原代细胞系NCH601、NCH620、NCH644、NCH441、NCH421k和NCH636采用无血清癌症干细胞培养基培养为神经球。作者开发了一种环境，在半固体3D基质中，肿瘤干细胞在无血清条件下生长，提供了一种保持干细胞样特征的环境。使用XRAD320 x射线设备(Precision X-ray, North Branford, CT)，在320 KeV的0-，2-和4-Gy光子照射这些细胞。质子和碳离子的粒子辐照是用铅笔束在一个1.5厘米宽的布喇格峰上进行的，相当于14.0厘米深的水。质子束能量最高可达221 MeV/u，碳离子束能量最高可达430 MeV/u[102-104]。用0-、2-和4-Gy光子照射GSC后，分2步检测存活分数(SF)。 At first colonies were initially manually counted. Sphere-like colonies were counted using microscopy 2 weeks after irradiation. Two response patterns of GSC were observed after irradiation with increasing doses. NCH644 and NCH421k were most resistant to photon, with 40-50% SF2GyX and 20-25% SF4GyX. On the contrary, survival of NCH441, NCH663, NCH620, and NCH601 was reduced by increasing doses, with SF2GyX values ranging between 3% and 17%, and SF4GyX values ranging between 0.5% and 2%.

随后，四种抗光子辐射的GSCs(即NCH644、NCH421k、NCH441、NCH636)和人U87MG GBM细胞以4 gy光子、质子或碳照射。通过荧光测定细胞存活率。数据显示，NCH644 (SF4GyX 87%， P<0.137)和NCH421k (SF4GyX 81%， P<0.0001)是两种最耐光子的GSCs，其辐射反应性与U87 (SF4GyX 80%， P<0.023)相似。与光子照射相比，4-Gy质子照射GSCs和U87的生存率仅略有下降。4戈瑞等剂量的碳离子照射显示出明显的细胞杀伤，显示出最高的存活率降低。质子照射的克隆生存证明相对生物有效性(RBE)在0.7-1.20范围内。然而，碳辐照使耐光子GSC培养物变得敏感，RBE在1.87-3.44范围内。

与非GSCs相比，GSCs的放射抗性部分是由于其DNA修复能力(33,105)。与光子照射相比，碳离子照射24小时后，核γ-H2AX染色阳性的GSCs比例更高(2.4倍)，表明残留的未修复双链断裂。同样，与光子照射相比，碳离子照射在推定的胰腺干细胞中增加了持续性γ-H2AX病灶(32,106)。这些结果表明，癌症干细胞对碳离子的敏感性可能表现为GSCs修复碳离子诱导的DNA双链断裂的能力受损。碳照射可有效消除GSC, RBE在1.87-3.44范围内。该研究表明，碳离子放射治疗可能成为胶质母细胞瘤的一种治疗方法。

碳离子照射抵消头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中癌症干细胞的迁移和侵袭过程:大约三分之二的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者在诊断时表现为晚期疾病[107-109]。联合治疗包括手术和放射治疗加或不加化疗或分子靶向治疗[110-112]。然而，无论采取何种治疗措施，HNSCC仍与高复发率相关[113,114]。此外，转移性疾病仍然是癌症死亡的主要原因[115116]。细胞迁移和侵袭是转移现象的基本步骤[117,118]。Moncharmont及其同事报道，2 Gy的光子照射显著增加了源自喉复发癌的头颈部鳞状细胞癌细胞(SQ20B细胞)[29]的迁移和侵袭。此前有几项研究报道了光子辐射增强迁移[119,120]。光子辐射后，EGFR被辐射诱导的细胞应激激活[121,122]。EGFR增强可能与激活细胞内信号通路有关，导致基质金属蛋白酶(MMP)分泌[121,123,124]。

癌细胞的一个亚群，即癌症干细胞(CSCs)，表现出过度的迁移和侵袭潜力[125,126]。这些细胞存在于HNSCC中，过表达CD44和醛脱氢酶(ALDH)蛋白，目前被认为是HNSCC CSCs的标志物[127-129]。Moncharmont和同事报告了连续的细胞分选，利用Side population (SP)从SQ20B亲本群体中分离出SQ20B/ csc。在基础条件下，SQ20B/ csc的迁移和侵袭能力大于SQ20B亲本细胞。这些能力与它们的间充质表型有关，表现为高N-cadherin表达和低E-cadherin表达[29]。这些表型特征与其他研究报道的CSCs呈现间充质表型相似[130,131]。头颈部鳞状细胞癌中肿瘤干细胞(CSCs)的侵袭性特征(高迁移和侵袭潜力)可能解释了其对常规化疗和放疗的耐药性[29]。各种改善晚期SCCHN局部控制和长期生存的手段已被应用[132,133]。

EGFR抑制通过调节细胞增殖和增强肿瘤的放射敏感性，在减少肿瘤细胞再生中发挥重要作用[134,135]。西妥昔单抗(Cetuximab)是一种嵌合免疫球蛋白G1单克隆抗体，可抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，并在鳞状细胞癌中增加辐射的细胞毒性作用[136,137]。

Beuve及其同事报告称，与光子辐射相比，高线性能量转移(LET)辐射诱导的相对生物有效性(RBE)增加了两倍[138]。Mizoe及其同事证明碳离子照射治疗恶性黑色素瘤和头颈部腺样囊性癌有效[139,140]。

Moncharmont等观察到2 Gy光子照射不能抑制SQ20B细胞和SQ20B/CSCs的细胞增殖。西妥昔单抗治疗或联合西妥昔单抗和光子照射治疗可减少SQ20B的增殖。SQ20B/CSCs增殖未见减少。与SQ20B/CSCs (0.77 vs 0.73，使用和不使用西妥昔单抗，p = 0.62)相比，使用西妥昔单抗后SQ20B计算出的SF2显著降低(分别为0.81 vs 0.62, p = 0.007)。碳离子辐射降低了SQ20B和SQ20B/CSCs的生存分数，在10%生存率时，相对生物有效性(RBE)分别为1.6和1.8。碳离子辐射联合西妥昔单抗完全抑制了SQ20B细胞的迁移和侵袭(p < 0.01和p < 0.005)。西妥昔单抗对SQ20B/CSCs的生存分数无影响。碳离子辐射显著降低SQ20B/ CSCs的迁移能力(p < 0.05)。碳离子照射和西妥昔单抗联合治疗后，SQ20B/CSCs亚群的侵袭显著减少(p < 0.005)。

这些结果表明，头颈部肿瘤干细胞存在一个亚群，具有高迁移和侵袭能力、低EGFR表达和对西妥昔单抗耐药的特点，这可能是颈内鳞状细胞癌常规治疗后局部复发和远处转移的原因。与光子照射相比，碳离子照射减少了头颈部鳞状细胞癌细胞和癌干细胞的迁移和侵袭过程，是一种很有前途的治疗方式。

碳离子束联合顺铂可有效破坏三阴性乳腺癌干细胞样细胞在体外：三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)，为什么雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)阴性的肿瘤具有侵袭性、预后差、靶向治疗少的原因[141,142]。乳腺癌干细胞样细胞(BCSC)群体最近在细胞膜标记CD44+/CD24-/ ESA+细胞的基础上被识别[143,144]。BCSCs具有自我更新和多谱系分化、致瘤性、化疗和放疗耐药性等能力，这些特征可解释肿瘤进展、疾病复发和转移[145,146]。因此，开发创新的CSC靶向疗法至关重要[147,148]。

重离子束在组织中呈现特定的范围和轻微的散射，在光束路径的末端具有良好的局部能量沉积;这被称为“扩散布拉格峰(SOBP)”，这是带电粒子束的一个独特的物理特征。这导致在它们活动范围的尽头释放出巨大的能量。因此，与传统辐射相比，这些离子束会带来更多不依赖于细胞周期和氧化的、不可修复的DNA损伤，并根除更多耐药癌细胞[149,150]。最近，一项重离子照射治疗早期乳腺癌的I期临床试验注意到，由于碳离子放疗后对皮肤、肋骨和肺部的不良影响，剂量增加的局限性，特别是对一些侵袭性乳腺癌亚型，如TNBC[30,151]。作者认为碳离子束联合化疗可能会降低照射剂量，但在消除乳腺癌方面仍有一定优势[30151]。化疗与重离子放疗的结合可能为对抗这一具有挑战性的乳腺癌亚群开辟新的手段，这种亚群预后差，治疗选择非常有限。

Sai和同事们研究了碳离子束单独或联合CDDP对三阴性(TN) BCSCs存活、DNA修复以及与x射线照射相比各种基因表达的变化的影响。从MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中分离出的人TNBCSCs单独或联合CDDP进行碳离子照射或x射线照射。随后[30]进行菌落、球形和肿瘤形成试验，RT-PCR阵列基因表达分析，免疫荧光γH2AX病灶试验。

集落、球形形成和致瘤性实验证实CD44+/CD24-和ESA+/CD24-细胞具有CSC特性。x射线照射后CD44+/CD24-细胞百分比呈剂量依赖性增加，而等量碳离子照射后CD44+/CD24-细胞百分比无明显变化。与碳离子束结合CDDP相比，x射线结合CDDP时CD44+/CD24-细胞比例明显增加。CSCs在D10水平上的RBE值约为2.14，而非CSCs的RBE值约为1.78。这些数据表明，碳离子束更有效地消除CSCs[30]。

碳离子束与25 μM的CDDP结合时，与单独碳离子束或x射线与CDDP结合时相比，CSCs和非CSCs形成的菌落数量显著减少。同样，从MDA-MB-231细胞中分选出的CD44+/CD24-细胞，碳离子束照射后肿瘤球形形成较x射线照射后明显减少;当碳离子束与CDDP结合时，这些离子进一步减少。MDA-MB-453中ESA+/CD24-细胞的成球能力在碳离子束单独照射下明显受到抑制，而在CDDP[30]和碳离子束联合照射下则明显受到抑制。

RT-PCR阵列分析MDA-MB-231细胞中抗辐射CSCs (CD44+/CD24-细胞)的多基因表达变化，发现碳离子束与25 μM CDDP联合处理5天，与x射线、顺铂单独或x射线联合顺铂相比，凋亡相关细胞色素c的表达显著升高，Bax和自噬相关基因LC3的表达显著升高。这些结果表明，碳离子束处理联合CDDP可能对诱导多细胞死亡有更大的作用。此外，碳离子束联合CDDP几乎消除了CSC标记CD44和ESA的表达，而x射线、CDDP单独或x射线联合CDDP显著增加了ESA的表达。碳离子束联合CDDP可显著抑制HIF1α、CD26等血管生成和转移相关基因的表达，而顺铂单独或x线联合CDDP可显著提高HIF1α、CD26的表达。因此，碳离子束照射联合CDDP可能是抑制肿瘤血管生成和转移的有效方法。

免疫荧光实验表明，在碳离子束照射、x射线照射和CDDP联合作用1小时后，从mdamb -231细胞中分离的CD44+/CD24-细胞中形成了大量的γH2AX焦点。然而，碳离子照射24 h后，诱导的γH2AX病灶水平仍明显高于相同剂量的x射线照射细胞。碳离子束联合顺铂较碳离子束、x线照射、单用顺铂或x线联合顺铂可明显提高γH2AX病灶数。此外，与碳离子束照射、x射线照射、单独顺铂照射或x射线照射顺铂处理的细胞相比，碳离子束照射联合顺铂处理的细胞中常见的病灶(簇状DSB)不仅在数量上有显著增加，而且在大小上也有显著增加。用免疫荧光法测定了MDA-MB-453细胞中ESA+/CD24-细胞在碳离子束照射24 h后形成的γH2AX核灶的数量和大小，x射线单独照射和25 μM CDDP联合照射均显示碳离子束照射CDDP[30]后形成的γH2AX核灶的丰度要大得多。

这些结果表明，碳离子束联合CDDP对TNBC细胞杀伤的主要作用主要来自于有效消除耐辐射的TNBCSCs。碳离子照射与CDDP联合使用为靶向TNBCSCs提供了强有力的证据，因为与传统的x射线或碳离子照射相比，碳离子照射具有复杂的DNA损伤、细胞凋亡、自噬和随后的细胞死亡。

碳离子束对假定结肠癌干细胞的影响及其与x射线的比较:结直肠癌是全球第三大常见癌症，也是发达国家癌症相关死亡的第二大原因[152,153]。完全切除肿瘤是局限性结肠癌唯一的治愈治疗方式。然而，尽管最近在手术辅助治疗方面取得了进展，局部晚期结肠癌的治疗结果仍然令人沮丧[154,155]。因此，研究创新的治疗策略，以解决肿瘤侵袭邻近组织、广泛转移、化疗和放疗耐药等导致治疗效果不佳的问题。

由于重离子放射治疗在治疗各种人类抗辐射肿瘤方面具有明显的优势，Cui和同事们假设重离子照射可能有效地靶向癌症干细胞。他们研究了重离子照射在靶向人类结肠癌干细胞[31]方面是否比x射线更有优势。结肠腺癌细胞系HCT116和SW480从American Type Culture Collection获得。为了测定克隆性和在悬浮液中生长为“肿瘤球”的能力，BD FACSAria (Becton Dickinson)分离了HCT116和SW480细胞，以获得CD133++和CD133-， CD44+/ESA+和CD44- /ESA-细胞群。碳离子束的初始能量为290 MeV/n, 50KeV/mm, SOBP为6 cm。将计算得到的深度剂量分布与实测值[31]进行比较，得到辐照部位重离子束的能量。

用6 Gy的碳离子或x射线照射HCT116和SW480细胞，并根据集落形成测量其存活率。用x射线和碳离子辐照的HCT116和SW480的存活部分随着剂量的增加而呈指数下降。根据生存曲线，D10计算出碳离子束的RBE值约为1.63 ~ 1.74。从HCT116细胞和SW480细胞中分别分离CD133+、CD44+/ESA+细胞后，CD133+、CD44+/ESA+细胞表现出更高的克隆能力和球状形成能力在体外在异种移植模型中具有强烈的致瘤性。数据表明CD133+、CD44+/ESA+细胞表现出癌干细胞样细胞[31]的特征。

FACS(荧光激活细胞分选)分析显示，与碳离子照射相比，x射线照射后CD133、ESA和CD44阳性的癌干样细胞的百分比更丰富。2或4 Gy x射线照射后CD133+/ CD44+和ESA+/CD44+细胞的百分比增加2 ~ 3倍。相反，1、2 Gy碳离子照射[31]后CD133+/ CD44+和ESA+/CD44+细胞的百分比降低或保持不变。

从HCT116或SW480细胞系中分离出的癌干样细胞经X射线和碳离子照射后，其存活分数随剂量的增加呈指数下降。根据生存曲线，在D10水平下计算出癌干细胞样细胞的RBE值约为2.05 ~ 2.28，而非癌干细胞样细胞的RBE值约为1.22 ~ 1.44。根据肿瘤生长延迟，计算出相对于x射线，6 cm SOBP中部50 keV/mm碳离子的RBE值为3.05 ~ 3.25[31]。

用H&E染色检查x射线或碳离子束照射4周后异种移植瘤的组织病理学改变。组织病理学特征显示，大多数肿瘤细胞未被15 Gy x射线或5 Gy碳离子照射破坏。15 Gy碳离子辐照主要引起结肠癌细胞空化、纤维化和导管样结构的完全破坏。相反，30 Gy x射线照射仅能不完全破坏结肠癌细胞，而保留了导管样结构。这些结果表明，30 Gy碳离子照射[31]后，肿瘤细胞几乎全部消失。

在活的有机体内FACS分析显示，15 Gy和/或30 Gy x射线照射1个月后，CD133+/ ESA+癌干样细胞百分比增加。然而，在60 Gy x射线照射1个月后，这些癌干样细胞显著减少。相比之下，15 Gy的碳离子照射没有改变癌干样细胞的百分比，而30 Gy的碳离子照射显著降低了癌干样细胞的百分比[31]。

研究结果证实，低LET x射线照射可从根本上根除非茎样肿瘤细胞，从而明显丰富了耐辐射的癌茎样细胞群。相比之下，碳离子照射可以同时根除非茎样和茎样肿瘤细胞;随后，癌干样细胞的比例略有增加或保持不变。简而言之，碳离子照射是一种有前途的治疗方式，因为它改善了对假定的结肠癌干细胞样细胞的靶向性。

碳离子束和x射线对胰腺癌干细胞样细胞克隆生存和DNA修复的不同影响:胰腺癌约占全球每年新诊断癌症的3%，是美国和欧洲癌症相关死亡的第四大原因[156-158]。这是一种侵袭性疾病。尽管最近的治疗取得了进展，但它仍然是一种致命的恶性肿瘤，5年总生存率(OS)不超过5%[156,157,159]。细胞表面标记CD44、CD24和上皮特异性抗原(ESA)已被报道为检测胰腺癌干细胞的标记。CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞表现出自我更新、产生分化子代的能力以及在发育信号通路中必不可少的分子表达增强的干细胞特征[160,161]。

放射治疗通常用于癌症治疗，依赖于电离辐射诱导的DNA损伤，特别是DNA双链断裂(dsb)的诱导。H2AX磷酸化是检测辐射诱导DSB的敏感标记[162,163]。辐射诱导的γH2AX焦点的数量与DSB的数量密切相关(164,165)。缓慢修复或未修复的DSB可能是细胞死亡的原因[32166]。碳离子照射由于RBE高、无氧效应、细胞周期辐射敏感性较低，被认为是比x射线照射更有效的治疗方法[32,167]。此外，一些研究表明，与光子辐照诱导的dsb相比，重离子辐照诱导的dsb修复动力学较慢[168]。

从人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和BxPc-3细胞中分离出癌干细胞样细胞，用无血清培养基培养。分别用碳离子或x射线照射或不照射这些细胞，然后进行集落、球形、成瘤试验及γH2AX成灶试验。CD44+/CD24+细胞的克隆形成能力明显高于CD44−/CD24−细胞。CD44+/CD24+细胞形成球形体的能力明显高于CD44−/CD24−细胞。CD44+/CD24+细胞的致瘤性也远高于CD44−/CD24−细胞。数据表明，从MIA PaCa-2和BxPc-3细胞分离的CD44+/CD24+细胞表现出癌干细胞样细胞[32]的特征。

用x射线和碳离子束照射的MIA PaCa-2和BxPc-3细胞的存活分数随着剂量的增加呈指数下降。在D10水平下计算的碳离子束RBE值为1.85-2.10。在x射线和碳离子束照射后，从两个细胞系分离出的癌干样细胞的存活部分随着剂量的增加呈指数下降。癌干样细胞在D10水平上计算的RBE值为2.0 ~ 2.19。与x射线照射的细胞相比，碳离子照射的两种细胞系的肿瘤干细胞样细胞形成肿瘤球体的数量显著降低。在x射线照射或碳离子照射后1小时或6小时，CD44+/CD24+和CD44−/CD24−细胞中均观察到大量γH2AX灶。然而，碳离子照射24小时后，γH2AX病灶水平仍明显高于x射线照射细胞。只在碳离子束辐照的细胞中发现病灶(聚集DNA损伤)的大小显著增加。此外，x射线照射后CD44+/CD24+细胞形成的γH2AX焦点数量比CD44−/CD24−细胞明显减少，这表明CD44+/CD24+细胞具有更强的修复x射线诱导的dsb的能力，这可能是其更强的放射抗性的主要原因。

与碳离子照射相比，x射线照射后癌干样CD44+/CD24+细胞比例更丰富。x射线照射后，MIA PaCa-2和BxPc-3细胞中癌干细胞样CD44+/CD24+细胞的比例显著增加3- 6倍，而碳离子照射后MIA PaCa-2细胞中癌干细胞样CD44+/CD24+细胞的比例仅增加一倍，BxPc-3细胞中癌干细胞样CD44+/CD24+细胞的比例下降。这些数据表明，癌症干细胞样CD44+/CD24+细胞可能对x射线具有抗性，导致非癌症干细胞样CD44−/CD24−细胞的选择性杀伤，从而导致癌症干细胞样细胞的相对比例上升。然而，碳离子照射可以同时消除非茎样和茎样肿瘤细胞，而人群中癌症干细胞样细胞的百分比变化极小。x射线或碳离子束照射后癌干样细胞的存活分数随剂量的增加呈指数下降，从MIA PaCa-2和BxPc-3分离的癌干样细胞在D10水平上计算的碳离子RBE值为2.0 ~ 2.19;这表明碳离子照射可能对消除癌干细胞样细胞非常有用。相反，从MIA PaCa-2中分选的非癌干样细胞在D10水平上的RBE值仅为1.47，说明碳离子束与x射线对胰腺癌细胞的杀伤差异本质上可能是碳离子辐照对癌干样细胞[32]的强大作用所致。总之，这些发现证明了利用碳离子照射靶向抵抗常规放射治疗的胰腺癌干细胞的潜在好处。

讨论

最近的研究结果表明，肿瘤具有细胞层次，癌细胞亚群具有比其他癌细胞更大的致瘤潜力。这种高度致瘤的细胞亚群位于层次结构的顶端，由癌症干细胞(CSCs)组成，并沿各种谱系[5]产生不同分化水平的祖细胞和细胞。

CSCs具有自我更新的能力，并通过茎性途径分化为各种肿瘤成分，如Wnt、TGF-β、STAT和希波- yap /TAZ。正常干细胞的干性通路受到严格的调控，并调节许多重要的生物学过程。相反，CSCs中的干性通路高度失调。CSCs依赖于不同的重编程途径来保持干性，并在癌症的进展中发挥作用。CSCs的精确靶向，配合化疗或放疗，可能实现稳定缓解或帮助治愈癌症[2]。

Chen及其同事的研究表明，褪黑素通过改变胶质母细胞瘤干样细胞(GSCs)生物学和抑制GSC增殖来精确靶向胶质瘤肿瘤细胞。AKT-STAT3-EZH2信号通路和EZH2磷酸化在GSC的生长中发挥重要作用。褪黑素减弱了AKT的激活、EZH2 S21的磷酸化、EZH2- stat3的相互作用和改变组蛋白修饰以减少肿瘤的发生和传播。这些结果表明褪黑素降低了与GSC自我更新和生存相关的多个关键信号[17]。

atp结合盒(ABC)转运体的药物外排是CSC治疗耐药机制之一[169]。abc转运蛋白因参与多种人类癌症的多重耐药而闻名[170]。ABC转运蛋白家族中的三种蛋白被全面检测为肿瘤多药耐药的调节因子，包括p -糖蛋白(P-gp, MDR1, ABCB1)、多药耐药蛋白1 (MRP1, ABCC1)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP, ABCG2)[171,172]。这三种转运蛋白在药物特异性方面有广泛的重叠，使肿瘤对主要化疗药物和分子靶向治疗具有耐药性[32,33,173]。phosphodiesterase-5抑制剂和fumitremorgin-type indolyldiketopiperazine Ko143抑制ABCG2转运蛋白活性可能会增强化疗药物的疗效[174,175]。此外，Martin及其同事证明，褪黑素通过诱导ABCG2/BCRP转运蛋白启动子[18]的甲基化来调节其表达和功能，从而提高化疗药物的疗效，靶向肿瘤体和脑肿瘤干细胞(BTSCs)。这一结果提示ABCG2/BCRP功能下调可能与褪黑素和化疗药物[18]的协同毒性作用有关。基于此，褪黑素可能是对抗胶质母细胞瘤治疗多药耐药的候选药物。

OCT4是POU家族成员，是癌症干细胞自我更新和维持多能性所必需的转录因子[60176]。经E2或BPA处理的乳房微球显著增加了ER与OCT4转录位点OCT4-3544中推定的ERE(雌激素反应元件)序列的结合。相反，暴露于E2或BPA并使用褪黑素处理的乳腺球显示，ER与OCT4转录位点OCT4-3544中假设的ERE序列的结合显著减少。此外，暴露于E2或BPA的乳腺球在OCT4启动子区-1999 kb处略微增强了ER与ERE位点的结合。当使用褪黑素[20]治疗乳房微球时，这种增强作用减弱。

自噬在溶酶体中捕获、降解和回收细胞内的蛋白质和细胞器。在大多数情况下，自噬促进肿瘤的发生[177]。癌症能够上调自噬以在微环境压力下生存，并增强生长和侵略性。抑制自噬以改善癌症治疗的尝试已经引起了极大的关注[177]。Martin及其同事的研究表明，褪黑素抑制BTSCs增殖，并诱导自我更新和克隆生成能力的降低，同时干细胞标记物的表达减少。此外，该研究还表明，褪黑素治疗诱导细胞死亡，具有自噬[21]的超微结构特征。

最近的研究指出了上皮细胞-间充质转化(EMT)和癌症干细胞(CSC)形成之间的联系。EMT参与干细胞样特征的获取和维持，足以赋予分化的正常细胞和癌细胞干细胞特性。此外，CSCs通常表现出EMT特性。EMT与CSCs之间的这种相互关系可能与肿瘤的进展有关[178]。Goncalves及其同事的研究表明，褪黑素对乳腺癌乳腺微球的活力和侵袭性具有抑制作用，并抑制乳腺CSCs[19]中与EMT相关的OCT4、N-cadherin和vimentin蛋白的表达。

肿瘤内缺氧、抗辐射诱导的凋亡、DNA双链断裂(dsb)的高修复能力以及某些癌基因和肿瘤抑制基因的突变与肿瘤对x射线放射治疗的耐药性有关[179]。肿瘤内缺氧是癌细胞抗x射线的主要原因。低预处理瘤内pO₂值与x射线放射治疗后的不良结果有关。相反，碳离子放疗在局部晚期宫颈癌患者中显示出良好的抗肿瘤效果，与预处理瘤内pO无关₂的水平。癌细胞对辐射诱导的凋亡的抵抗是另一个在x射线抵抗中起作用的关键因素。碳离子能有效消除x射线照射诱导的耐凋亡癌细胞。癌细胞具有很强的双链断裂(DSB)修复能力，因此产生了x射线抗性。碳离子诱导的复合dsb比x射线诱导的dsb更难修复;这些持续未修复的dsb会导致有丝分裂大灾难[179]。

胶质瘤干细胞(GSCs)与肿瘤的发生、复发和耐药有关。cd133阳性胶质瘤细胞表明胶质瘤具有放射抗性，被认为是放疗后肿瘤复发的来源。Huynh和同事证明了GRP78，一种抗应激蛋白，在与GSCs发育相关的GBM细胞中高表达。当GRP78沉默时，GSC特性被抑制，辐射敏感性增加[180]。4个光子抗辐射GSCs和U87MG GBM细胞用4 gy光子、质子或碳照射(28)。细胞存活数据表明，NCH644和NCH421k是两种最耐光子的GSCs。等剂量4戈瑞的碳离子辐照显示明显的细胞杀伤。碳离子辐照能有效根除GSC[28]。

大量证据表明，癌细胞与肿瘤间质细胞之间的串扰对于获得侵袭和转移能力至关重要[181]。2 Gy光子照射可显著增加头颈部鳞状细胞癌细胞(SQ20B细胞)[29]的迁移和侵袭。碳离子辐射显著降低了SQ20B/ CSCs的迁移能力。碳离子照射可能是一种有前景的治疗选择，因为与光子照射相比，碳离子照射可以抵消头颈部鳞状细胞癌细胞和CSCs的迁移和侵袭过程。

Sai和同事研究了XRCC4与人结肠癌干细胞对x射线或碳离子束的放射敏感性之间的关系。XRCC4是NHEJ (non-homologous end-joining，用于双链断裂)的成员，可能在致癌过程中发挥重要作用。XRCC4失活显著致人结肠癌干样细胞放射增敏。与碳离子照射相比，x射线可显著增强癌干样细胞标记物的表达[182]。碳离子照射可同时消除非茎样和茎样肿瘤细胞;相应地，癌干样细胞的比例略有增加或保持不变。与30 Gy x射线照射相比，15 Gy碳离子照射诱导了更明显的异种移植瘤细胞空化和纤维化，而没有明显增强推定的癌症干细胞标记细胞。碳离子照射是一种很有前途的治疗方式，因为它可以更好地靶向结肠癌干细胞。

由于存在内在和获得性放射抵抗，大多数诊断为胰腺癌的患者并没有获得实际的反应。区分降低放疗疗效的分子机制并靶向这些途径对于改善胰腺癌患者的放疗反应很重要[183]。在Oonishi及其同事的研究中，与碳离子照射相比，x射线照射后癌茎样CD44+/CD24+细胞的比例更丰富。x射线照射后，癌干细胞样CD44+/CD24+细胞的比例显著增加3 ~ 6倍，而碳离子照射[32]后胰腺癌干细胞样细胞的比例仅增加一倍或减少。碳离子对胰腺癌干样细胞的RBE值在2.0 ~ 2.19之间，表明碳离子束对胰腺癌干样细胞具有明显的清除能力。

结论

癌症干细胞表现出过度的迁移和侵袭潜能。这些细胞具有自我更新和多能性，在肿瘤内产生所有细胞，并负责肿瘤生长、治疗耐药性和转移。

褪黑素减弱AKT激活、EZH2 S21磷酸化、EZH2- stat3相互作用和改变组蛋白修饰以减少脑肿瘤干细胞(BTSC)的肿瘤起始和增殖。褪黑素减少了与BTSC自我更新和生存相关的多个关键信号。褪黑素通过诱导ABCG2/BCRP转运蛋白启动子甲基化来调节其表达和功能，从而提高化疗药物的疗效，靶向肿瘤体积和BTSCs。ABCG2/BCRP功能下调也可能与褪黑素与化疗药物的协同毒性作用有关。褪黑素可能是一个有价值的候选人，以抵消多药耐药治疗胶质母细胞瘤。褪黑素治疗诱导细胞死亡，具有自噬的超微结构特征。

褪黑素抑制了E2和BPA治疗对乳腺球生长的影响，以及ERα和干细胞标志物OCT4的表达。褪黑素治疗可有效抑制乳腺癌干细胞(BCSCs)增殖并影响ER通路。BCSCs对褪黑激素的响应方式是降低乳腺癌乳腺球的活力和侵袭性，并调节BCSCs中与EMT相关的OCT4、N-cadherin和vimentin蛋白的表达。

与光子照射相比，碳离子照射24小时后，脑肿瘤干细胞(BTSCs)核γ-H2AX染色呈阳性的比例更高(2.4倍)，记录了残留的未修复双链断裂。癌症干细胞对碳离子的敏感性可能是BTSCs修复碳离子诱导的DNA双链断裂能力受损的结果。碳照射可有效消除BTSCs, RBE为1.87-3.44。

头颈部肿瘤干细胞亚群，具有高迁移和侵袭能力，EGFR低表达，对西妥昔单抗耐药的特点，可能促进治疗后头颈部鳞状细胞癌的局部复发和远处转移。碳离子照射似乎是一种很有前途的治疗方式，因为与光子照射相比，碳离子照射可以抵抗头颈部鳞状细胞癌细胞和癌症干细胞的迁移和侵袭过程。

碳离子束联合CDDP对TNBC细胞杀伤的主要作用是有效消除耐辐射的TNBCSCs。碳离子照射联合CDDP在靶向TNBCSCs方面具有显著优势，因为与常规x射线或碳离子照射相比，TNBCSCs具有复杂的DNA损伤、细胞凋亡、自噬和随后的细胞死亡。

在活的有机体内FACS分析显示，15 Gy和30 Gy x射线照射1个月后，CD133+/ ESA+结肠癌干细胞样细胞百分比增加。相比之下，30 Gy的碳离子照射显著降低了结肠癌干细胞样细胞的百分比。低LET x射线照射可基本根除非茎样肿瘤细胞，从而明显丰富了耐辐射的癌茎样细胞群。相比之下，碳离子照射可以同时根除非茎样和茎样肿瘤细胞。碳离子照射显然是一种有希望根除假定的结肠癌干细胞样细胞的药物。

从人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和BxPc-3细胞中分离出来的癌干细胞样细胞经碳离子辐照后形成的肿瘤球体数量明显低于x射线辐照后的细胞。x射线或碳离子照射后癌干样细胞的存活分数随剂量增加呈指数下降，从MIA PaCa-2和BxPc-3分离得到的癌干样细胞碳离子的RBE值约为2.0 ~ 2.19，表明碳离子束具有明显的消除胰腺癌干样细胞的潜力。

进一步的研究以阐明癌症干细胞的机制和分子途径，特别是与褪黑素和碳离子照射相关的机制和分子途径当然是有必要的。最后，考虑到褪黑素和碳离子照射在改变肿瘤中癌症干细胞特征方面的类似作用，使用这两种药物的联合治疗可能非常值得。

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