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收稿日期:2018年10月23日
接受日期:2018年11月8日
发布日期:2018年11月12日
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©2018 Du Z.这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，在注明原作者和来源的情况下，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制。
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杜志，杨强(2018)应用测序技术分析恶性肿瘤特别是耐药复发性卵巢癌遗传信息的研究进展。临床试验4:DOI: 10.15761/CRT.1000240
中国医科大学附属盛京医院妇产科，辽宁沈阳
中国医科大学附属盛京医院妇产科，辽宁沈阳
DOI: 10.15761 / CRT.1000240
第二代测序(NGS)技术在当代肿瘤研究中发挥着重要作用。为肿瘤突变基因和耐药基因的检测提供了一种快速、准确的方法。ctDNA是来源于肿瘤细胞的DNA，可以实时准确地反映肿瘤基因组的变化。它在癌症研究的各个领域也发挥着不可或缺的作用。本文将对ctDNA的应用、NGS检测的应用现状以及检测ctDNA在卵巢癌耐药和复发中的变化进行阐述和总结。
ctDNA，第二代测序NGS，卵巢癌，耐药复发
卵巢癌是严重威胁妇女生命安全的恶性肿瘤，其致死率居女性生殖器官恶性肿瘤之首。由于早期临床症状和体征相对隐匿，不易被发现，且由于缺乏有效的筛查方法，往往70%的患者在就医时大多为晚期，并伴有盆腔和腹部的光转移。目前晚期卵巢癌的治疗以手术为主，结合化疗、放疗等综合治疗，其中铂基化疗是晚期卵巢癌的主要辅助治疗。但即使作为最常用的一线化疗药物，其原发性或继发性耐药也是卵巢癌治疗的一大障碍，也是导致晚期卵巢癌患者5年生存率难以超过30%的主要原因之一。卵巢癌患者经过初期治疗后，约有70%-80%的患者出现复发。卵巢癌的复发定义为化疗持续时间相对较短，在6个月内发生。但对于耐药复发卵巢癌患者，铂基化疗不能继续，药物选择少，治疗困难，生存期短，预后差。因此，找出卵巢癌铂耐药的原因是我们迫切需要解决的问题。这也是合理选择卵巢癌有效药物的前提。近年来的研究表明，肿瘤的异质性在卵巢癌的耐药中起着非常重要的作用[1]。
肿瘤异质性是肿瘤复发转移的重要表现，也是组织活检的主要制约因素[2,3]。肿瘤的异质性表明同一肿瘤在不同区域表现出不同的遗传特征(即肿瘤内异质性)。同样，在同一患者的转移性肿瘤中也存在异质性(即转移异质性)[1]。由于肿瘤具有异质性，因此手术或活检所获得的病理组织只能揭示肿瘤单位点的遗传信息，并不能充分揭示肿瘤的生物学特性和动态变化，进而影响临床治疗方案的选择和疗效评价的准确性。循环肿瘤DNA (ctDNA)，又称液体活检，可以弥补组织活检的缺陷，它反映的是患者血液循环变化的肿瘤基因组信息而非单位信息，突破了肿瘤异质性的限制，为实时动态监测肿瘤全基因组信息提供了技术可能性[4]。
虽然肿瘤组织是临床和研究测序的金标准，但组织的获取和应用仍然很困难。从采样的角度来看，活检并不是一种简单的方法。此外，活检增加了护理费用，使患者感到不舒服，但这种侵入性检查不会影响结果。最后也是最重要的一点是活组织检查可能有临床并发症。MD安德森癌症中心报告显示，气管活检和腹部及盆腔活检的不良事件发生率分别为17.1%和1.6%[5]。
除了组织获取问题外，利用肿瘤组织进行基因测序还受到样本保存问题和组织异质性问题的影响。大多数肿瘤组织保存在福尔马林固定石蜡包埋块中，并与DNA交联。在某些情况下，保存的样品不能在分子分析中得到充分的分析。尽管这种方法在单基因突变和靶基因集方面已经得到了改进，但在全基因组外显子分析方面仍然存在局限性。此外，每次活检中癌细胞的数量不同，很大程度上受肿瘤细胞密度(肿瘤的百分比)和所需样本的大小的影响，癌细胞的数量也受细针穿刺或粗针活检中组织数量的影响。与术中切除的样本相比，穿刺获得的肿瘤组织数量较少。
单个肿瘤的活检或部分组织切片将失去肿瘤的异质性和转移。理论上，循环肿瘤DNA (ctDNA)可以提供与组织活检相同的遗传信息。CtDNA是一类双链DNA片段，大小为0.18~21kb。它们起源于肿瘤细胞。它们主要存在于肿瘤患者的血液、滑液和脑脊液中，并可通过患者的尿液和粪便排出体外。CtDNA也被称为“液体活检”，可以反映肿瘤基因组信息的全貌，因此可以突破肿瘤异质性的限制。另一方面，它是新鲜DNA的来源，不受防腐剂的影响。使用微创技术，使用针管进行血液取样，以避免活检的风险。此外，在治疗期间可随时抽血，动态监测肿瘤分子变化[6-8]。ctDNA片段包含与肿瘤本身相同的遗传缺陷。 These DNA changes include all types of genomic alterations in the tumor, such as point mutations (EGFR and KRAS), rearrangement (EML4-ALK), gene proliferation (HER2 and MET) and aneuploidy [1].
作为肿瘤的动态标志物，ctDNA比传统的蛋白质标志物和影像学检查具有更多的优势。ctDNA的半衰期很短(约2小时)，因此它可以对几个小时的肿瘤变化作出反应，而不是几周或几个月[9]。因此，ctDNA的变化比影像学检查或蛋白标记物早几周甚至几个月[10]。此外，CA125等蛋白标记物不仅在恶性肿瘤患者中升高，在良性肿瘤和炎症患者中也升高。ctDNA的另一个特点是高度敏感。研究表明，IV期肿瘤患者液体活检的敏感性接近100%[11]。虽然ctDNA在晚期癌症中的敏感性很高，但必须明确的是，ctDNA的敏感性主要受生物学和技术因素的影响。当存在低级别肿瘤或小转移时，ctDNA的含量也会降低。严格意义上，ctDNA检测的灵敏度也受到DNA聚合酶错误率(通常为0.01%)的限制。因此，如果样品中ctDNA片段的错误率小于等于0.01%，则认为该ctDNA为阴性。 Another important advantage of ctDNA analysis is highly specific, which can be used to detect tumor specific molecular changes in the blood circulation. Because the ctDNA mutation is targeted to the tumor individual and exists in the tumor DNA, it does not appear in the normal cell DNA. Because of its high sensitivity and specificity, ctDNA can be used for molecular heterogeneity assessment, monitoring tumor dynamics, identifying gene therapy factors, tracking the evolution of genome and development of drug resistance. Therefore, it has a broad application prospect in exploring the molecular mechanism of tumor recurrence and metastasis and drug resistance [1].
应用高通量基因测序(NGS)检测技术可以检测体液中ctDNA的含量，从而获得肿瘤突变和癌细胞特异性抗原的驱动基因信息，进而发现新一代的生物标志物。随着肿瘤基因组的研究，越来越多的肿瘤相关基因组信息被发现。现在我们知道几乎所有种类的癌症都与体细胞的基因突变有关。这些类型的突变包括单碱基替换、插入突变、缺失突变和染色体易位(基因融合、基因扩增、杂合性丧失)。在整个细胞群中，这些体细胞的突变频率很低，因此可以从生物学角度作为特异性的生物标志物[12]。
在Bettegowda的一项研究中，可以从所有410名癌症患者中检测到基因突变，这使得ctDNA成为癌症患者的进一步生物标志物。此外，在80%以上的转移性肿瘤患者中检测到的ctDNA水平远高于其他传统生物标志物，如蛋白质标志物CA125、CEA等。与蛋白标记物不同，基因突变只发生在肿瘤细胞中，但蛋白标记物不仅存在于肿瘤细胞中，也存在于正常细胞中[13]。
最近的一项研究表明，血浆ctDNA完整性对乳腺癌的早期诊断有价值，ctDNA浓度结合CFDI(无细胞完整性)对早期诊断原发性乳腺癌(PBC)和转移性乳腺癌(MBC)具有重要价值。该研究对383例乳腺癌患者进行了研究，其中PBC患者82例，MBC患者201例，健康对照100例。结果表明，ctDNA浓度联合CFDI可以很好地区分原发性乳腺癌、转移性乳腺癌和健康对照[14]。
2013年，Da等学者对结直肠癌患者的研究表明，血浆CFDI在结直肠癌的诊断中具有重要的价值。本研究纳入27例非手术治疗的结直肠癌患者、33例结直肠癌患者和33例健康对照，结果显示，手术组与非手术组、手术组与健康对照组、非手术组与健康对照组血浆CFDI值差异均有统计学意义[15]。
此外，莱辛斯基，et al。[16] 2014年的研究结果表明，在结肠癌的诊断中，ctDNA的完整性是有价值的。
CtDNA还可以实时、动态、无创地监测肿瘤负荷的变化，可作为一种新的生物标志物应用于临床研究。路易斯的研究结果，et al。提示转移性肿瘤患者ctDNA检测可指导临床治疗，监测肿瘤复发，提示预后。例如，转移性结直肠癌(CRC)患者的低水平ctDNA预示着良好的预后。这一结论提示ctDNA浓度与存活率之间存在相关性。同样的结论也出现在对晚期乳腺癌患者的研究中[1]。此外，在一项胃癌病例对照研究中，研究人员比较了手术前后血浆ctDNA水平的变化。结果显示，血浆ctDNA水平明显低于术前。因此，ctDNA定量可以用来评价肿瘤患者手术切除的完全性，即手术切除越完整，ctDNA含量越低，ctDNA定量也可以很早就提示肿瘤的转移和复发[17]。
此外，许多研究表明，ctDNA也可以用于判断癌症患者的预后，准确率很高。勒孔特的一项研究表明，等。探讨外周血ctDNA K-ras基因突变和CDKN2A启动子高甲基化在结直肠癌预后中的价值，本研究对37例结直肠癌患者进行平均22个月的随访，并进行生存分析。结果显示，K-ras基因突变和CDKN2A启动子超甲基化患者的2年总生存率(48%，95% CI 26%~66%)明显低于未发生上述基因突变患者的总生存率(100%)。COX回归分析显示，ctDNA K-ras基因突变和CDKN2A启动子高甲基化是CRC的独立预后因素。该结果进一步说明了K-ras基因突变或CDKN2A启动子高甲基化对结直肠癌患者预后的重要价值，也有望成为预测结直肠癌患者复发风险的生物标志物。2012年发表的一项研究发现，高水平的K-ras基因突变与CRC预后不良有关。本研究对108例转移性结直肠癌患者采用西妥昔单抗联合伊立替康治疗，定量检测治疗前血浆ctDNA中K-ras和BRAF突变水平。结果显示，K-ras突变水平在75%以上的患者疾病控制率显著低于低水平突变患者(P<0.048)。Cox回归分析显示，ctDNA中K-ras基因的突变水平与转移性CRC的预后显著相关。高水平K-ras基因突变的CTC患者预后较差[18]。 A similar report was also reported in a study on changes in plasma ctDNA in patients with metastatic breast cancer in 2013 by Dawson,et al。[19]。
近年来，许多学者致力于监测外周体液中ctDNA特异性基因的改变，如基因突变类型、拷贝数变化等，以达到疗效评价的目的。例如，在一项转移性乳腺癌的研究中，结果表明ctDNA比循环肿瘤细胞、碳水化合物抗原153 (CA153)和影像学检查更早地反映疾病进展和治疗效果[19]。在另一项转移性乳腺癌和卵巢癌的研究中，血浆样本被用来追踪肿瘤特异性突变基因的动态变化。结果表明，ctDNA可以反映临床病程[20]。
部分肿瘤靶向治疗患者可获得获得性耐药。例如，在Diaz的一项研究中，et al。[21]利用ctDNA监测相关突变基因，评价靶向治疗的疗效。研究人员发现，对于K-ras野生型转移性CRC患者，部分患者在帕尼单抗靶向治疗后仍有一定的耐药性。在对这些患者的ctDNA进行检测后，发现K-ras基因突变在治疗前以低频亚克隆的形式出现，在5 ~ 6个月的随访中，在人群的ctDNA中发现了38%的K-ras突变，在9例患者中发现了BRAF基因的新突变。结果表明，通过监测ctDNA靶向治疗的基因谱变化，可以评估靶向治疗的疗效，并在临床治疗中以此为基础调整药物的选择。而目前将体液ctDNA与肿瘤组织DNA进行比较，特异性基因变化检测的敏感性、特异性和一致性还缺乏统一的结论，需要临床数据进一步验证。Hickey的研究，et al。在卵巢癌患者的血清和腹水中检测到ctDNA。结果表明，部分分子变异与患者的临床分期、疗效评价及预后密切相关。首歌,et al。有报道称，利用NGS检测晚期肺癌组织样本和匹配的血液样本中的ctDNA，符合率可达76.2%[22]。伊芙琳风管,et al。[23]在结直肠癌患者中检测了46个基因，比较了KRAS/PIK3CA/BRAF/EGFR等4个基因的一致性。19例IV期患者的符合率为93%，19例I-III期患者的符合率为54%。然而，唐家诚，et al。[24]报道肝癌患者组织DNA和体液ctDNA的基因检测显示，样品的特异性、敏感性和一致性存在很大差异。
耐药卵巢癌的复发可能是由多种因素引起的，包括患者自身的变化和肿瘤细胞基因的变化。这是癌症治疗中最严重的问题。肿瘤细胞耐药的高频率提示肿瘤中存在特殊的分子机制。癌基因是细胞生长和分化过程中原癌基因的异常形式。当被特定的点突变、染色体移位、基因扩增或其他机制激活时，原癌基因可能转化为癌基因，通过干扰细胞凋亡导致细胞异常增殖或刺激细胞异常存活。目前，很多研究都对致癌基因在卵巢癌发生发展中的重要作用进行了全面的评估[25]。
据报道，卵巢癌的多药耐药可能与CXCR4、NRP1、ACO1、BDNF和HMGCR有关。5个上调基因和CDKN2C、FAS、SKP2, 3个下调表达基因[26]。CXCR4编码趋化因子受体4 (chemokine receptor 4)，受体配体基质细胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor-1, SDF-1)特异性结合，在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用，并参与肿瘤的进展和预后。在Kwong、CTCE-9908 (CXCR4受体拮抗剂)治疗和紫杉醇治疗卵巢癌患者的研究中，结果显示联合用药可诱导卵巢癌细胞有丝分裂障碍，增加细胞毒性，因此得出CXCR4有望成为卵巢癌治疗的新靶点[27]。NRP1是血管内皮生长因子(VEGF)的受体，是多种人类恶性肿瘤潜在的抗肿瘤治疗靶点。NRP1可以促进癌症干细胞的自我更新能力。其在癌组织中的高表达会严重影响患者的预后，在卵巢癌的发展中具有重要意义[28]。NRP1在癌组织中的过表达严重影响患者的预后。它是包括卵巢癌在内的人类多种恶性肿瘤潜在的抗癌治疗靶点[29,30]。其他研究报道AKT1、AKT2、BAX、EGFR、JUN、MYC、NFKB1、PIK3CA、RAS和SRC是卵巢癌耐药的关键调控因子。 AKT and BAX is a downstream gene in a number of oncogene mediated ovarian cancer resistance pathways and plays a central role.
卵巢癌多药耐药往往涉及多种因素，如信号转导、代谢途径、蛋白酶途径、DNA损伤与修复等。一些信号通路如MAPK、PI3K/AKT、BAX被激活[31-33]，或一些信号通路如P53失活[34,35]，也可能影响细胞的生长、增殖、分化和凋亡，从而形成卵巢癌的多药耐药。本文将简要介绍和总结这些信号路径。
许多研究证实，MAPK信号通路与卵巢癌化疗耐药密切相关。目前已发现MAPK家族包括ERK、ERK3、ERK5/BMK1、ERK7、ERK8、JNK、NLK、P38 MAPK等8个亚群。在上皮性卵巢癌中，铂类药物的剂量与ERK1/2和JNK的持续激活密切相关。ERK1/2和JNK的持续激活可诱导DNA损伤和细胞凋亡。然而，ERK1/2和JNK信号的持续激活也可以诱导卵巢癌细胞产生铂耐药。相反，通过抑制ERK1/2信号的持续激活，可增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性[32,33]。也提示ERK1/2通路的激活和P38MAPK通路的失活可诱导卵巢癌细胞对铂类药物的耐药。此外，MAPK1也被称为ERK，被认为参与了与卵巢癌耐药相关的MAPK1介导的MAPK信号通路[31]。
卵巢癌耐药的机制是刺激细胞存活，阻断细胞凋亡。PI3K/AKT信号通路是癌细胞存活的主要途径。AKT可被多种刺激激活，如生长因子、蛋白激酶抑制剂等。例如，actn4mrna的表达可以增加AKT的磷酸化，刺激AKT的移位和细胞增殖。PTEN是PI3K/AKT通路的负调控因子。PTEN的降低还可导致AKT磷酸化的增加和活化，从而促进细胞存活和增殖，阻断细胞凋亡，最终导致铂耐药的发生。
BAX是一种细胞死亡刺激剂，与抗凋亡BCL2蛋白同源。BAX和BCL2或BCL2样1 (BCL-XL，也称为BCL2L1)可以形成杂合的两种聚合物。BAX介导的细胞凋亡取决于BAX的相对量，即细胞中是否出现BCL2和/或BAX:BCL-XL异源二聚体。如果出现异源二聚体，BAX的量就会减少。bax介导的细胞凋亡减少。BAX诱导的细胞凋亡途径是化疗诱导细胞死亡的必要途径，因此BAX的下调与化疗耐药密切相关。此外，BAX也是多种卵巢癌耐药相关基因的下游基因。这些结果表明BAX和AKT在卵巢癌耐药中的重要作用[31]。
P53是一种肿瘤抑制基因，参与诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和DNA修复。许多研究证实P53信号通路与卵巢癌的发病和预后有关，铂类化疗的敏感性与P53的功能状态密切相关[36,37]。P53基因调控网络(P53信号通路)最早由Vogelstein提出。et al。在2000年。指出在P53基因调控网络中，细胞的生命活动受基因相互作用的调控。其中，MDM2-P53-P21WAF1/CIPI是P53信号通路中最重要的通路，该通路中任何一个基因出现异常都可能导致肿瘤的发生。
凋亡和磷酸化是卵巢癌癌基因耐药的两种最重要的生物学途径[31]。细胞凋亡是生理平衡中不可分割的一部分，细胞凋亡与耐药性的关系取决于在细胞增殖和分化过程中谁更占优势。例如，癌基因BCL2是细胞凋亡的负调节因子，通过减少细胞凋亡来促进耐药。DOK2可通过抑制细胞凋亡诱导卵巢癌卡铂耐药[36]。磷酸化和去磷酸化可以调节生长因子和细胞因子的信号转导，从而调节细胞的繁殖、分化、存活和凋亡以及癌症的发生发展[37]。许多与卵巢癌耐药相关的基因的表达也受到磷酸化的调控，如AKT、SRC和STAT3[38,39]。此外，错配修复等其他通路的激活也可诱导卵巢癌化疗耐药的产生。
BRCA2基因是致癌基因。13q12-13是卵巢癌和乳腺癌的一组，在抑制、癌变和预后之间有着重要的关系。基因组DNA约70kb，编码10987bp，有27个外显子。第11外显子是最大的外显子。它是DNA修复相关蛋白51 (DNA damage repair protein 51, RAD 51)的结合位点。BRCA2的mRNA长约10kb，编码一个由3418个氨基酸残基组成的肿瘤抑制BRCA2蛋白。
BRCA2与RAD51在同源重组[40]和DNA损伤修复功能上密切相关。在BRCA2的羧基末端，有一个结构域称为BRCA2 DBD (DNA/ dss1结合域)结构域，该结构域包含5个类似于DNA结合基元的结构域:Screw、OB1、OB2、OB3结构域和结构域塔。当BRCA2在肿瘤中发生突变时，5个错义结构域突变的发生率分别为25%、25.4%、8.6%、8.6%和32.4%。当DNA双链损伤时，DNA损伤会发出信号，该信号会被进一步激活，如共济失调毛细血管扩张基因(ataxia-telangiectasiamutated, ATM)、抗凝血酶(antithrombin receptor, ATR)受体样激酶活性可催化BRCA2/RAD51蛋白复合物的磷酸化[8]。从无活性形式转化为活性形式，然后，BRCA2蛋白携带RAD51蛋白转运到常见的双链DNA损伤位点参与双链DNA损伤修复的重组，发挥抑瘤作用。
BRCA2突变细胞存在同源重组功能缺陷，DNA损伤也可导致RAD51核聚集不足。DNA修复缺陷可产生另一种结果，这种结果对广泛使用的抗癌药物DNA损伤剂高度敏感。DNA损伤剂在DNA修复缺陷的肿瘤细胞中具有突出作用[41]。BRCA2突变的卵巢癌患者均对铂敏感，但这部分患者终仍会对铂产生耐药性。
本研究提示，一些携带原发肿瘤的抑癌基因的二次突变可能与获得性铂耐药有关，如TP53、乳腺癌易感基因1和2 (BRCA1和BRCA2)，如TP53、乳腺癌易感基因1和2 (BRCA1和BRCA2)。研究表明，在携带阅读框移位突变的BRCA1和BRCA2卵巢癌中，获得性铂耐药性是由该基因的两个突变产生的。纠正突变体BRCA1/2的开放阅读框(Open Reading frame, ORF)，恢复野生型BRCA1/2的表达和DNA同源重组修复功能，导致卵巢癌获得性铂耐药的发生。在BRCA2突变的胰腺癌或卵巢癌细胞系中，可通过顺铂或聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(聚adp -核糖聚合酶(PARP)抑制剂)诱导BRCA2的两种突变[42]。由于这种恢复突变，截断的BRCA2蛋白被更新并具有同源重组的功能。因此，BRCA2突变发生两次铂类药物在BRCA2突变肿瘤中的使用是获得性的。耐铂的机理。
BRCA2使DNA损伤修复功能缺失，细胞遗传不稳定增加卵巢癌的发病率，而卵巢癌对铂基DNA损伤剂敏感，BRCA2两次突变后，在携带移码突变的BRCA2卵巢癌中，纠正了突变体BRCA2的开放阅读框，恢复了野生型BRCA2的表达和DNA同源重组修复功能。这导致了卵巢癌获得性铂耐药的发生。然而，目前BRCA2 2基因突变诱导的卵巢癌耐药并不是很清楚。
综上所述，化疗是卵巢癌患者的重要治疗方法。虽然卵巢癌患者的初期疗效较高，有研究指出，经紫杉醇和铂类药物等一线化疗的晚期患者初始反应率高达80%，完全缓解率为40%~60%，但多数患者会复发而死亡，资料显示70%~80%的患者复发，5年生存率仍在30%~45%左右。导致化疗失败和生存率提高的主要因素是化疗耐药的出现[26]。因此，寻找解决化疗耐药的有效途径是一个迫切需要解决的问题。
利用NGS检测技术，可以在血液循环中检测肿瘤特异性分子变化，实时动态检测肿瘤全基因组信息。因此，在探索肿瘤复发、转移及耐药的分子机制方面具有广阔的应用前景。这项技术的出现，正符合当前肿瘤“精准医疗”的发展趋势。因此，利用NGS技术分析ctDNA对卵巢癌耐药的分子机制，可能为卵巢癌复发患者的治疗开辟新的局面。
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杜志，杨强(2018)应用测序技术分析恶性肿瘤特别是耐药复发性卵巢癌遗传信息的研究进展。临床试验4:DOI: 10.15761/CRT.1000240
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