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摘要

背景/目的:我们的研究目的是评估金属蛋白酶-3的组织抑制剂的甲基化水平之间的关联（TIMP3）肾细胞癌（RCC）的风险。

方法:进行了从PubMed，Embase，Web的相关文献进行了系统审查，并进行了Cochrane图书馆数据库。计算赔率比（或）及其相应的95％置信区间（CI）以分析数据并获得综合结果。

结果：本meta分析10种符合条件的文献，包括495例RCC标本和409例正常对照。结果表明TIMP3启动子高甲基化与rcc风险增加相关(OR=12.16, 95% CI: 3.64-40.66, P<0.001)。亚组分析结果显示，尿亚组的OR (OR=22.16)大于组织亚组(OR=13.15)和血液亚组(OR=3.20)。此外，5项包含RCC临床病理特征的研究结果表明，RCC的甲基化水平TIMP3基因与低分期相关(OR=2.77, 95% CI: 1.48-5.18, P=0.001)。

结论:我们的结果表明，甲基化水平TIMP3RCC中启动子区显著。此外，这一发现与肿瘤的早期分期有关。的检测TIMP3启动子甲基化可能是早期诊断肾细胞癌的一个好方法。然而，还需要更多精心设计的研究来进一步证明我们的结论。

关键字

TIMP3，启动子，甲基化，肾癌，荟萃分析

介绍

肾细胞癌是一种潜在的致命肿瘤，约占所有肾癌的90%，是泌尿系统第三常见的恶性肿瘤[1,2]。肾细胞癌的发病率和死亡率在世界范围内以每十年约2-3%的速度逐渐增加[3]。在美国，2016年报告了约62700名新诊断的肾癌患者和14240例肾癌死亡[4]。迄今为止，手术切除是RCC的主流治疗方法，对局限性癌患者显示出良好的疗效。然而，早期肾细胞癌是诊断过程中的一个严重问题，因为肾细胞癌通常无症状。大约20-30%的肾细胞癌患者在新诊断时已经发展为远处转移[5]。然而，没有可靠的生物标志物，可以支持临床医生在早期检测肾细胞癌。

DNA甲基化是在没有DNA序列改变的情况下调节基因表达的重要表达机制之一，并且参与肿瘤的发生和发育[6]。基因促进剂高甲基化占DNA异常甲基化的大多数异常甲基化，并且与一些功能基因失活相关，特别是那些涉及人类癌症中肿瘤抑制基因的那些[7,8]。金属蛋白酶-3的组织抑制剂（TIMP3)映射到染色体22q13.2的基因是金属蛋白酶基因家族的组织抑制剂[9]。TIMP3蛋白质参与了癌症的进展;它破坏了血管内皮生长因子信号通路[10]的活性。Methylation-associated沉默的TIMP3该基因在包括肾细胞癌在内的不同癌症中发挥肿瘤抑制作用[11]。尤其是TIMP3肾细胞癌患者尿液标本中检测到的启动子甲基化明显高于健康人[12-14]，提示它可能是肾细胞癌的一种无创生物标志物。然而，相关研究的结果TIMP3RCC中的基因甲基化仍有争议。在本研究中，我们在一些广泛使用的电子数据库中仔细查找相关文献，并进行meta分析，以获得全面的数据。

材料和方法

文献综述

通过众所周知的电子数据库中的系统搜索来识别相关文献，例如在2017年4月之前的Pubmed，Embase，Cochrane图书馆和科学数据库网站和科学数据库网络。使用以下关键词:(甲基化或高甲基化）和（肾脏或肾脏）和（癌症或癌或肿瘤）和（TIMP3或金属蛋白酶抑制剂3）。纳入标准总结如下：（1）所附的文章可以提供足够的信息TIMP3在rcc患者的组织，血液或尿液样本中检测到的甲基化水平和正常对照或关于之间的相关性的估计TIMP3RCC启动子甲基化与临床病理特征。(2)研究报告必须用英文发表。(3)肾细胞癌经病理诊断明确。最近的研究或有大量数据的研究只有在有重复数据时才纳入。排除无病例对照资料的文章。

数据采集

两名评论员（S.M.和Z.S.）独立提取了数据。来自每个包括研究的有用信息如下提取：第一个作者的姓氏，出版物，区域，样品源，肿瘤组织学型，样品大小，肿瘤阶段，核等级以及甲基化检测方法。正常对照标本衍生自健康人或与RCC相邻的正常组织。肿瘤阶段（T1-2）被视为低阶段，否则高阶段。组织学等级（G1-2）被归类为低等级，否则高等级。

统计分析

统计结果揭示了两个因素之间的相关性TIMP3基因甲基化水平与RCC的风险。汇集的赔率比（或）和95％置信区间（CI）用于代表结果。Cochrane的Q测试和Higgins I²进行统计以检验统计异质性[15]，并使用亚组分析和元回归进行分析。根据p值和I值的结果选择不同的效应模型²统计。如果p> 0.05或i²选择50％，选择适合于低异质性的固定效果模型（Mantel-Haenszel方法）进行使用。否则，选择了随机效果模型（Delsimonian-Laird方法）。此外，通过敏感性分析评估我们结果的稳定性。用漏斗绘图大致推断出版物偏差，并用Egger的测试和Begg的测试定量检查。使用Stata 12.0软件（Stata Corporation，TX，USA）分析所有统计数据。P <0.05表示显着的统计水平。

结果

研究过滤

搜索和选择文章的过程如流程图所示（图1）。通过检索数据库，初步鉴定出305种文献。然后，将重复的、无关的或数据不足的文章排除在外。最终，在1999年至2013年间发表的10篇文章[11-14,16-21]符合我们的标准。其中检测到两篇文章[12,13]TIMP3基因甲基化不仅存在于组织组，也存在于尿组或血型中，或两者都存在。我们独立地分析了每一组。所有合格研究的有用数据列于表1。

图1所示。文献搜索和选择流程图。

表1。纳入研究的特点。缩写:RCCs:未声明的肾细胞癌;PC:乳头状细胞癌;M:甲基化;U: unmethylation;MSP:甲基化特异性聚合酶链反应;QMSP:定量甲基化特异性聚合酶链反应;尿液中TIMP3启动子甲基化的评估研究;b评估血液中TIMP3启动子甲基化的研究。

第一作者	一年	地区	方法	样本类型	组织学类型	样本大小	情况下		控制
							米	U	米	U
巴赫曼	1999	美国	MSP	组织	rccs.	36.	28.	8	0	27.
Esteller	2001	美国	MSP	组织	rccs.	36.	28.	8	0	36.
Battagli	2003年	美国	MSP	组织	rccs.	45.	26.	19	0	10
Battagli-u一个	2003年	美国	MSP	尿	rccs.	45.	23.	22.	0	24.
德拉大地	2004年	美国	MSP	组织	rccs.	86.	50.	36.	0	15
Hoque-u	2004年	美国	QMSP.	尿	rccs.	17	9	8	8	83.
Hoque-bb	2004年	美国	QMSP.	血	rccs.	17	3.	14	0	30.
凯恩斯	2004年	美国	MSP	尿	rccs.	50.	30.	20.	0	24.
科斯塔	2007	葡萄牙	QMSP.	组织	rccs.	75.	13	62.	15	47.
on	2009	火鸡	MSP	组织	rccs.	21.	4	17	2	19
埃林格	2010	德国	QMSP.	组织	个人计算机	32.	2	30.	0	15
豪泽	2013年	德国	QMSP.	血	rccs.	35.	20.	15	21.	33.

研究非均质性

我们的meta分析存在显著的异质性(I²= 80.4％）。随后，我们进行了亚组分析和元回归以找到异质性来源。如表2所示，通过测试方法，材料和区域分层数据。定量甲基化特异性聚合酶链反应（QMSP）的检测方法和组织样品占异质性的部分（I²对于QMSP为76.3％和i²组织学检查为85.5%。在元回归分析（表3）中，异质性归因于方法（P=0.026），而非材料异质性（P=0.607）。因此，部分异质性来自甲基化检测方法。

表2。TIMP3启动子甲基化与肾细胞癌风险相关性的亚组分析。

变量	研究	肿瘤		控制		合并效果			异质性
		米	U	米	U	或（95％）	Z	P	我2（％）	P
全部的	12	236	259.	46.	363	12.16（3.64-40.66）	4.06	0	80.4%	0
方法
MSP	7	189.	130.	2	155.	38.30 (9.02 - -162.64)	4.94	0	51.5%	0.056
QMSP.	5	47.	129	44.	208	2.93（0.83-10.34）	1.67	0.094	76.3％	0.002
材料
组织	7	151.	180.	17	169.	13.15（1.53-112.72）	2.35	0.019	85.5%	0
血	2	23.	29.	21.	63.	3.20（0.65-15.67）	1.43	0.020	33.3％	0.221
尿	3.	62.	50.	8	131.	22.16 (5.57 - -88.10)	4.40	0	24.8%	0.264
地区
美国	8	197.	135.	8	249	32.33（13.32-78.45）	7.69	0	8.9%	0.361
欧洲	4	39.	124	38.	114	1.33 (0.63 - -2.79)	0.75	0.456	29.4%	0.236

表3。元回归分析。

变量	系数	95%置信区间	我2-剩余	调整后的R2	P值
方法	-2.53	(-4.67, -0.38)	65.24％	45.93％	0.026
材料	0.38	(-1.21,1.96)	75.70%	-7.38％	0.607
地区	-3.24	（-4.69，-1.79）	8.57%	88.78％	0.001

与关系TIMP3启动子甲基化与RCC风险

频率TIMP3促进剂高甲基化在RCC病例和正常对照中。如森林图所示（图2），TIMP3启动子高甲基化与RCC发生率显著相关(OR=12.16, 95% CI: 3.64-40.66, P<0.001，随机效应模型)。在亚组分析中，尿样亚组的OR (OR=22.16)大于组织亚组(OR=13.15)和血液亚组(OR=3.20)。

图2。汇集或10项研究，包括495例RCC案例和409个正常对照。或= 12.16,95％CL：3.64-40.66，P <0.001。

关联TIMP3启动子高甲基化与RCC的临床病理特征．关于RCC临床病理学特征（肿瘤阶段和组织学等级）的数据如表4所示。含有明确的临床病理信息的五项研究包括在分析中，结果表明TIMP3启动子甲基化与肿瘤低分期相关(OR=2.77, 95% CI: 1.48-5.18, P=0.001，固定效应模型)(图3)，但与组织学分级无关(OR=1.70, 95% CI: 0.98-2.95, P=0.06，固定效应模型)(图4)。

表4。五项研究的临床病理特征。缩写:M:甲基化;U: unmethylation。

第一作者	一年	方法	样本类型	低品位		优质		较低的阶段		高阶段
				米	U	米	U	米	U	米	U
巴赫曼	1999	MSP	组织	14	5	14	3.	20.	5	8	3.
Battagli	2003年	MSP	组织	18	8	8	11	23.	11	3.	8
Battagli-u	2003年	MSP	尿	16	10	7	12	20.	14	3.	8
德拉大地	2004年	MSP	组织	29.	18	21.	18	39.	22.	11	14
on	2009	MSP	组织	4	15	0	2	4	14	0	3.

图3。汇总了五项研究的OR，评估了两者之间的关系TIMP3启动子甲基化和肿瘤阶段。或= 2.77,95％CI：1.48-5.18，P = 0.001。

图4。汇总了五项研究的OR，评估了两者之间的关系TIMP3启动子甲基化和组织学等级。或= 1.70,95％CI：0.98-2.95，P = 0.06。

敏感性分析

进行敏感性分析，通过评估删除单一研究对总合并ORs的影响，反映统计结果的稳定性和可信度。如图5所示，合并的ORs没有明显变化，表明我们的荟萃分析结果是稳定的。

图5。总体优势比系数的敏感性分析TIMP3甲基化。

出版物偏见

如图6所示，漏斗图的形状对称性模糊，采用Egger’s和Begg’s检验定量评估发表偏倚。Egger’s检验的p值为0.002,Begg’s检验的p值为0.858。进行了修剪和填充分析，以确定两项试验结论不一致的条件。结果之间的关系TIMP3在提高5种累积的研究后，甲基化和RCC风险也具有统计学意义（或= 1.29,95％CI：0.26-2.35，P = 0.02）。因此，Begg的测试和修剪和填充分析结果表明，我们的Meta分析中没有显着的出版物偏见。

图6。发表偏差的相关漏斗图TIMP3启动子甲基化和RCC风险。

讨论

DNA异常甲基化调节基因表达而不改变DNA序列，并且广泛参与血管生成。基因启动子区的高甲基化与某些功能基因的转录沉默和失活相关，例如人类癌症中的肿瘤抑制基因和DNA损伤修复基因[22,23]。TIMP3基因，发现于染色体22q13.2，是一个肿瘤抑制基因。它参与抑制人类癌症的生长、血管生成、侵袭和转移[24-26]。减少TIMP3表达与各种恶性肿瘤中的异常启动子甲基化有关，包括肾癌[11,27]，膀胱癌[28]，甘露曲序列[29,30]，食管鳞状细胞癌[31]，脑膜瘤[32]和胃癌[33]。

然而，研究两者之间的关系TIMP3启动子甲基化和RCC风险的结果不一致。在荟萃分析中,TIMP3通过甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）或qMSP检测方法检测组织、血液和尿液样本中的启动子甲基化。结果与肾细胞癌风险增加相关（OR=12.16，P=0.000）。然而，在这项荟萃分析中呈现出明显的异质性。荟萃回归和亚组分析表明，部分异质性来自甲基化检测方法。通常，qMSP的检测方法比MSP的检测方法具有更高的灵敏度[34]。正如先前的研究报告所述，TIMP3当使用qMSP方法时，一些正常肾组织样本中出现启动子甲基化；当进行MSP时，很难获得该结果[16,19]。同时，形态正常的人体组织可能会经历导致肿瘤发生的过程，特别是由于“场效应”（也称为场癌变）和逐渐的细胞遗传学改变而导致的异常甲基化[35]。按测试方法分层的亚组分析结果显示：TIMP3MSP检测到的启动子甲基化与RCC风险显著相关(OR=38.30)。这一发现表明我们的结果不受甲基化检测方法引起的异质性的影响。根据材料分层的子群分析结果，我们还发现TIMP3尿液亚组中检测到的启动子甲基化与肾细胞癌风险增加高度相关（OR=22.16）。因此TIMP3促进剂甲基化可能被开发成非侵入性和方便的生物标志物以诊断RCC。

以前的研究报道，基因的高甲基化水平TIMP3基因与肿瘤分期[11,13,18]和组织学分级[18]相关，而其他研究则无相关[12,16]。我们进行了五项研究，以产生RCC的临床病理数据来评估RCC发生频率之间的关系TIMP3启动子甲基化与肾细胞癌的临床病理特征。结果表明，甲基化水平TIMP3启动子区域与低肿瘤阶段有关（P = 0.001）。我们推测了异常的甲基化TIMP3基因参与肾肿瘤瘤的早期阶段。鉴于某些肿瘤伴有临床标本的DNA甲基化改变，例如血液，尿液和腹水[36,37]，研究TIMP3促进剂甲基化可能为早期检测和监测RCC提供有前途和非侵入性的方法。

在我们的研究中存在一些潜在的局限性:选择偏差是不可避免的，因为我们只在英语文献中搜索，可能会错过一些重要的其他语言的研究;纳入几年前(1999年至2013年)发表的文章，建议纳入新发表的研究;其他临床数据，如癌症亚型、年龄和性别，没有出现在我们的meta分析中，也与癌症无关TIMP3基因甲基化。

总体而言，我们的研究表明TIMP3促进剂高甲基化与RCC的风险密切相关并与低肿瘤阶段相关。具有足够的样本大小的额外精心设计的研究可以明确证明该作用TIMP3RCC启动子甲基化。

承认

基金资助:国家自然科学基金区域基金项目(No. 81460386)。

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