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摘要

本文利用红外光谱(IR)方法，研究了红细胞膜在正温度下储存过程中分子键水平上的结构变化。研究对象是红细胞(rbc)放入含有防腐剂CPD的袋子中，红细胞放入含有防腐剂CPDA-1的袋子中。作为膜保护使用的生理盐水之前处理过的磁铁矿纳米颗粒(ICNB)通过Belousov的方法。将经纳米颗粒处理过的生理溶液加入到保存的红细胞中。对照组为添加完整生理盐水。分析了对照样品和被试样品在CPD介质中储存的前28天的红外光谱变化。在红细胞控制中断时，红细胞的分子结构膜在贮存第14天开始发生明显的破坏性变化。三周后，红细胞分子结构膜被完全破坏。在测试样品中，只有在红细胞储存28天时，才出现了分子键的减弱和断裂。红细胞膜结构在贮存第35天完全破坏。 Analysis of changes occurring in the IR spectra of samples of control and test in the CPDA-1 medium was showed that during 49 days of storage. In the suspension of control of RBCs noticeable destructive changes in the molecular structure begins in four weeks, and after six weeks storage the molecular structure of erythrocytes membrane are completely destroyed. In the sample of test, a significant weakening of intra-and intermolecular bonds in the structure of erythrocytes membrane occurs after six weeks. However, the complete destruction of the structure is not observed. After seven weeks storage of erythrocytes obvious violations of the molecular structure of lipids and proteins that make up the RBCs are visible but some of the strongest compounds still remain.

总的来说，结果清楚地表明，由于减少了红细胞膜中蛋白质和脂类分子结构的破坏，纳米技术的应用方法显著增加了红细胞在不同版本防腐剂中的存储时间。本文提出的纳米技术应用方法不仅在血液服务、输血学和血液学的实际应用中是安全的，而且是最有前途的创新项目。

关键字

纳米技术，保存红细胞(rbc)，磁铁矿纳米颗粒(ICNB)，红外光谱(IR)方法，红细胞的分子结构，储存时间

简介

现状

在很长一段时间里，红细胞成分都是作为浓缩物制备的。红细胞浓缩物悬浮在营养添加剂溶液中。这些保存和延长了它们的保质期，允许冷藏6-7周[1]。在贮藏过程中，红细胞发生逐渐积累的理化变化[2,3]。目前，临床研究已经确认，在某些患者群体中，红细胞输血是发病率和死亡率增加的危险因素(文献[4-6]综述)。其中一些研究表明，输血年龄较大的保存红细胞在[6]患者中会引起更多的并发症。为了解决这些问题，人们重新对寻找减轻血液储存不良影响的方法产生了兴趣。这将提高RBC组件的质量、效率和安全性。然而，在寻找阻止红细胞储存损伤[7]的有害影响的方法方面进展缓慢。

尽管红细胞一直是细胞生物学家和生物化学家最喜欢的实验模型，但红细胞储存研究一再表明，关于红细胞的许多基础生物学仍然没有很好地理解。红细胞生物化学、细胞骨架结构和膜特性之间的相互关系非常复杂，因此很难预测红细胞在不同储存条件下的反应。将红细胞暴露在非生理的储存环境中，表明了红细胞中存在着以前未知的生化机制，包括凋亡样过程、行为与预期不同的离子和渗透通道、可能由于氧化和/或蛋白酶/糖苷酶活性或衰老改变而暴露新的或改变的受体[8-11]。

通过提高RBC组件的质量所获得的优势，远远超过了由于引入新一代RBC添加解决方案而导致的加工程序调整或额外加工成本带来的任何实际或想象的不便。

目前，纳米技术不仅为细胞损伤机制的研究开辟了新的前景，而且为开发有效和安全的细胞体外储存方法开辟了新的前景。

在乌克兰，Andrey N. Belousov于1998年制造了第一个生物兼容的医用磁铁矿纳米颗粒并获得了专利。这些是体内纳米生物矫正器(ICNB)、磁控吸附剂(MCS-B)和生物活性纳米装置(Micromage-B)[12]。

研究发现，磁铁纳米颗粒可调节红细胞中抗氧化系统的酶链活性，有效调节健康和疾病患者白细胞的代谢过程[13-15]。以往的复杂研究表明，在整体标准化生物相容性中，磁铁矿纳米颗粒对代谢过程具有非特异性和调节作用。对网内皮系统(肺、肝、肾)超微结构的研究证明，注射生物相容性磁铁矿纳米颗粒后可引起代谢过程的非特异性激活，增加细胞器细胞的潜能和适应机制，加速大分子和膜的修复过程[14,16,17]。磁铁矿纳米颗粒的吸附和磁性不仅可以通过(根据磁电泳原理)选择性地吸收表面膜细胞的蛋白质，还可以通过稳定活性基团的方式防止蛋白质的氧化修饰，使位于细胞表面膜上的受体状态正常化，增加酶的膜结合活性[18-20]。

在大鼠身上的实验表明，ICNB的生物相容性标准化纳米颗粒可以有效地用于MRI。在作用机理上，ICNB的纳米粒子引起了可转换的变化，这是近液氢质子迁移率暂时性增加的原因。它不可避免地改变了恶性肿瘤细胞的代谢过程，有望为恶性肿瘤[21]的靶向治疗开辟新的途径。这些研究结果不仅拓展了对磁铁矿纳米颗粒对胞外和胞内条件影响机制的认识，而且开辟了细胞代谢的新领域，确定了细胞酶在代谢调节过程中的膜作用[19,22-24]。

MCS-B纳米颗粒体外预处理可有效降低红细胞Ca、Mg - АТPHese活性(p<0.001)。

目前已有研究表明，磁性纳米颗粒可有效抑制肝素化血液的溶血，提高红细胞ATP和2.3 DPH活性，调节跨膜代谢，抑制脓毒症[19,25,26]。

在我们最近的研究中发现，在正温度下，经过纳米磁铁矿(ICNB)处理并添加到红细胞保鲜液中的生理盐水能有效地抑制红细胞在贮藏阶段的溶血过程(图1)。我们可靠地证实，经过纳米磁铁矿(ICNB)处理的生理盐水具有显著的稳膜作用。抑制溶血和增加保存红细胞的沉淀稳定性。总的来说，这些影响提供了保存红细胞在储存期间功能活性的可持续性。通过优化，建立了一种简单实用的保存液现代化新方法，提高了保存红细胞的质量、效率和安全输注[27-29]。

然而，综合分析上述数据仅揭示了盐水对保存红细胞作用的主要机制。考虑到这一点，决定对红细胞膜在储存过程中分子键水平上的结构变化进行深入研究。红外光谱(IR)方法是这些研究的有效方法之一。

图1所示。试验第35天采用与生产工艺相适应的添加剂现代化防腐剂溶液抑制溶血效果。

红外光谱(IR)是一种鉴别和分析化合物的方法。将一束红外光束对准样品，通过测量样品在不同频率下吸收的辐射，就可以知道样品是由哪种分子构成的[31,32]。该方法基于被研究对象的原子群在红外范围内吸收电磁辐射的现象。当分子受到红外辐射时，量子被吸收，量子吸收的频率与分子的价振频率、变形频率和振动频率对应。红外光谱使我们能够追踪所研究物质分子中所有主要类型的键的变化[33-36]。光谱显示在一个图表，显示在哪个频率和多少吸收发生。因为不同的分子以已知的量吸收特定频率的辐射，光谱可以用来在分子水平上识别样本。红外光谱(IR)在研究中用于定量分析，识别样品或检测杂质。红外可用于气体、液体或固体样品，在此过程中不破坏样品。红外光谱技术广泛应用于生物液体、血液及其成分[37]的分析。

因此，研究的下一个目的是研究在正温度下，红细胞保存液在贮藏阶段的添加现代化中红细胞膜分子结构的变化。

材料和方法

材料

1. ICNB的标准化体内纳米生物矫正剂被视为磁铁矿纳米颗粒。共沉淀法合成磁性纳米颗粒。ICNB的主要物理和化学性质数据如下表1-4所示;图2、3:

• 磁铁矿纳米颗粒胶体溶液在NaCl生理溶液中的浓度为0.0225%。
• 胶体溶液的理论渗透压为500莫摩尔/升
• 磁铁矿纳米颗粒粒径为6-12 nm;
• 纳米颗粒表面磁铁矿总面积Ss = 800-1200 m²/ g;
• 饱和磁化强度= 2.15 кА/m;
• ζ - potential = - 19

2. 9%氯化钠溶液。
3. 用ICNB按4:1的比例处理9% NaCl溶液。

图2。用离子电子光栅型量子200三维显微镜研究磁铁矿纳米颗粒。

图3。用显微镜电子半透明杰姆-2100研究磁性纳米颗粒。

研究的对象

• 红细胞(rbc)装入装有抗凝剂柠檬酸盐、营养磷酸盐和葡萄糖(CPD)的袋子;
• 血红细胞(红细胞)装入袋中，袋中含有抗凝剂柠檬酸、营养磷酸盐、葡萄糖和腺嘌呤(CPDA-1)。

每袋3毫升的红细胞被分配到20个无菌玻璃管中。然后，在前10管对照中加入2 ml量的0.9% NaCl溶液。在接下来的10管测试中加入2 ml的0.9% NaCl溶液，这是之前由ICNB处理过的。

因此，管子的分布如下:

管的控制:

• 红细胞(CPD) 3ml + 0.9% NaCl溶液2ml (n=10);
• 3 ml红细胞(CPDA-1) +2 ml 0.9% NaCl溶液(n=10)。

管的测试:

• 红细胞(CPD) 3 ml + ICNB处理过的0.9% NaCl溶液2 ml，比例为4:1 (n=10);
• 3 ml红细胞(CPDA-1) +2 ml经ICNB处理过的0.9% NaCl溶液，比例为4:1 (n=10)。

红外分光光度计-29 (LOMO)工作于乌克兰国家科学院的NSC哈尔科夫物理与技术研究所，用于登记红细胞水溶液在红外范围内的吸收光谱。光谱记录在4000-400 cm范围内^－1(从2至25 MKM -中红外区域)。

在已知的吸收极值频率下，对聚苯乙烯的光谱进行了校准。修正量平均为10-5厘米^－1．

液态水在研究范围内具有很强的吸收特性，因此记录水溶液的光谱是获得该物质的薄层的必要条件。为了这个目的，两薄板的CaF₂采用中红外范围透明的材料，没有自己的特征吸收带，这可能会影响水溶液的红外光谱的解释。一滴试验液体被压在两个圆板之间₂并安装在测量通道内的装置。同样的平板被安装在比较通道中，但没有液体。将样品放入设备后立即进行光谱记录，持续10分钟。实验室内温度为25-30°C。

试验分8个阶段进行:第1天- I、第7天- II、第14天- III、第21天- IV、第28天- V、第35天- VI、第42天- VII、第49天- VIII。

生化检查结束后的血液存放在+4ºС的冷藏室中。

用变量统计的参数化方法对所得结果进行统计处理。利用Excel软件对所得数据进行处理。

结果与讨论

红外吸收光谱在研究红细胞悬浮液初期在400-1300 cm范围内的对照和试验^－1和1200 - 4000厘米^－1如图4和图5所示。

由于所研究的红细胞悬浮液的基础是液态水，光谱中最强烈和最宽的波段对应于分子H的不同类型的振动₂O:

1. 强吸收范围在800-600厘米^－1对应H的振动模态₂O(图4)。
2. 由于价键角度的变化，N-O-N的变形振动看起来像一个1630 cm的窄强带^－1(图5)。
3. 变形振动与振动振动的复合振动模式₂O分子分布在2150-2100 cm之间^－1(图5)。
4. 水分子中键长变化引起的价振动的主要波段覆盖在3600-3000 cm的光谱范围内^－1(图5)。

此外，光谱中有几个波段对应于盐水中所含的红细胞防腐剂:

• 小范围峰系列:415,435,480,510,530和580厘米^－1(图4)。
• 宽波段，高度在1100厘米^－1(图4)。
• 弱强度峰值在1260和1400cm^－1(图5)。

图4。初始红细胞悬浮液的红外吸收光谱在400-1300 cm范围内^－1:曲线1-控制;曲线2 -测试。

图5。初始红血球悬浮液的红外吸收光谱范围为1200-4000 μ m^－1:曲线1-控制;曲线2 -测试。

因此，在光谱中可以区分出三个与红细胞结构的分子内波动直接相关的特征峰:1290、1450和1550 cm^－1(图5)。初步红细胞悬浮液的红外光谱吸收波段的识别见表5。

红细胞结构的主要碎片所对应的特征波段的光谱范围如图6和图7所示。这些波段可以被识别如下:

图6。CPD培养基中天然盐溶液中红细胞悬浮液的对照样品的红外吸收光谱:曲线1- I阶段(第1天);曲线2-阶段II(第7天);曲线3-第三阶段(第14天);曲线4-第四阶段(第21天);曲线5-阶段V(第28天)。

图7。由红细胞悬浮液组成的样品，在CPD培养基中用磁铁矿纳米颗粒处理过的盐水溶液中，其红外吸收光谱:曲线1- I阶段(第1天);曲线2 -阶段II(第7天);曲线3 -第三阶段(第14天);曲线4 -第四阶段(第21天);曲线5-阶段V(第28天)。

实验1(防腐剂CPD)

一个对照样本红细胞悬液在防腐剂CPD和完整的盐水溶液中五个阶段的研究结果如图6所示。弱强度峰值为1290 cm^－1可以归因于蛋白质环结构的波动，以及酰胺III[37]。弱峰1450厘米^－1为变形振动d(CH_3.)在脂类和蛋白质的结构中[38,39]。1550厘米处平均强度的锐带^－1n(n - h)+n(C-N) Amide II[37]的价振动。图5显示了样品暴露一周(第二阶段)后，所有这些与C-N价振动和N-H变形振动(1290,1450和1550 cm)相关的峰值强度^－1)是减少。这可能表明蛋白质二级结构开始发生变化。两周后(III期)，束带1290 cm^－1移向高频率(®1300 cm^－1)变成一个小弯，带1450厘米^－1酰胺II最强烈的峰值在1550 cm左右^－1明显削弱。

这些变化表明物质分子结构的退化和分子内和分子间键的减弱。储存三周后(IV阶段)，在对照红外光谱中完全平滑，红细胞的所有波段消失，在O-H(1650-1500cm)范围内出现较宽的模糊振动带^－1)．储存四周后(第五阶段)未观察到光谱的变化。鉴于后者，在接下来计划的阶段(阶段VI，阶段VII)中，红外吸收光谱的研究是不切实际的。

测试样本红细胞悬液在防腐剂CPD和盐水溶液中，之前经过ICNB处理，如图7所示。

第I阶段试验样品中红细胞悬液的红外光谱与对照样品的红外光谱基本相同，不同之处在于不是1290-1260 cm的双重态^－1有一个1300厘米的带^－1肩膀有1240厘米，几乎看不出来^－1(图7)。在接下来的两周内，没有观察到表明红细胞分子结构受到干扰的明显光谱变化。

1300和1550 cm的地震带强度^－1是下降，波段1450厘米^－1红细胞在第21天(第四阶段)完全消失。这些变化表明红细胞膜的蛋白质和脂质分子结构开始退化。在红细胞储存过程中，在红外光谱中，在水和条带保存溶液的背景下，几乎没有发现与分子内振动相关的过量现象，只有在观察的第28天(V阶段)出现。因此，红细胞的分子结构没有被破坏。

实验一总结

对对照样品和被试样品在CPD介质中红外光谱变化的分析表明:

1. 在红细胞控制中断时，红细胞的分子结构膜在第14天(III期)开始发生明显的破坏性变化。三周后，红细胞分子结构膜被破坏。
2. 在测试样品中，只有在红细胞储存28天时，才出现了分子键的减弱和断裂。红细胞膜结构在贮藏第35天(第6期)完全破坏。

实验2(防腐剂CPDA-1)

一个对照样本在研究的主要阶段，红细胞悬液在防腐剂CPDA-1和完整的生理盐水溶液中的情况见图8。

初始样品的红外光谱中含有与实验1相同的官能团波段。然而，由于样本来自献血者的特点，它们的强度有一些差异。红细胞储存三周后(第四阶段)，在光谱中没有明显的变化，表明红细胞膜的分子结构受到干扰。

图8。CPDA-1培养基中天然盐溶液中红细胞悬浮液的对照样品的红外吸收光谱主要阶段:曲线1-阶段1(第1天);曲线2 - V阶段(第28天);曲线3 -阶段VII(第42天)。

4周后(V阶段)，光谱出现明显变化(一些波段平滑，强度降低，小峰消失)。这些变化表明红细胞膜的蛋白质和脂质分子结构开始发生破坏。五周后(第六阶段)没有发现光谱的显著变化。红细胞储存六周后(第七阶段)，在振动范围为O-H (1650-1500 cm)的宽模糊带背景下，在光谱中几乎可以观察到与分子内振荡相关的显著过量^－1) H₂O表示红细胞膜分子结构完全破坏。

图9展示了ICNB在本研究的主要阶段中处理过的在防腐剂CPDA-1与盐水溶液中红细胞悬液的测试样本。

如图9所示，该样品分子结构的动态变化表明，红细胞储存四周后，它仍然完全稳定。红细胞储存四周后，条带的脂质和蛋白质强度出现轻微下降的第一个迹象。然而，这些变化比本系列的对照样本要小得多。

6周后，频谱的变化主要是由于高频区波段的移动和小峰的平滑。这表明红细胞结构中的分子内和分子间键明显减弱。然而，没有观察到红细胞膜结构的完全破坏。

储存7周后，光谱中只剩下一个弱带红细胞，对应于Amide II最稳定键n(n - h)+n(C-N)的价振动，该键之前(在对照样品中)由于该键的减弱，在高频区发生了显著的转移。蛋白和脂质分子的变形振动带消失，即红细胞的分子结构受到干扰。

图9。试验样品的红外吸收光谱包括红细胞悬液在防腐剂CPDA-1和之前由ICNB处理过的盐水溶液中:曲线1-阶段1(第1天);曲线2 - V阶段(第28天);曲线3 -阶段VII(第42天)。

实验二总结

分析了对照样品和试验样品在CPDA-1介质中储存49天红外光谱的变化。

1. 红细胞停止控制后，分子结构在4周内开始发生明显的破坏性变化，6周后红细胞膜的分子结构被破坏。
2. 在试验样品中，红细胞膜结构的分子内和分子间键在6周后发生了明显的减弱。然而，没有观察到结构的完全破坏。红细胞储存七周(第八阶段)后，构成红细胞的脂类和蛋白质的分子结构明显发生破坏，但一些最强的化合物仍然存在。

结论

红外光谱的方法可以跟踪红细胞膜分子中所有重要类型的键在正温度下储存阶段的变化动态。结果清楚地表明，纳米技术的应用方法显著增加了红细胞在不同版本的防腐剂中的存储时间，这是由于减少了红细胞膜中蛋白质和脂类分子结构的破坏机制。未来，我们计划利用纳米技术继续研究红细胞在正温度下贮藏阶段的代谢过程特征。

然而，今天很明显，纳米技术的应用方法不仅在血液服务、输血学和血液学的实践中是安全的，而且是最有前途的创新项目。

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