上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县351-0198
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
上海交通大学Bio-X研究所，发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室，上海，200240
理研脑科学研究所研究资源中心，日本埼玉县351-0198
DOI: 10.15761 / IMM.1000193。
神经元电压门控的Cav2.2通道介导突触前机制，负责神经递质的释放。在我们之前的研究中，接受了脑室内注射ω- cootoxin GVIA(一种Cav2.2阻滞剂)的小鼠，在纹状体和额叶皮层中显示出多巴胺和血清素的基线水平下降，这一缺陷导致了抑郁行为。然而，人们对Cav2.2在焦虑神经回路中的作用还知之甚少。在本研究中，小鼠脑室内注射ω-锥体毒素GVIA (5 pg/side)可导致升高+迷宫、明暗探索和大理石掩埋试验中的行为缺陷。这些结果表明，抑制cav2.2介导的信号传导可诱导参与焦虑相关行为的神经网络发生改变。
焦虑，Cav2.2，升高加迷宫试验，明暗探察试验，大理石埋藏试验，ω-Conotoxin GVIA
在突触前末端，两个主要的电压门控Ca2＋钙通道类型Cav2.1 (P/ q型)和Cav2.2 (n型)在钙通道中起重要作用2＋依赖神经递质[1]的胞外释放。Ca2＋通过这些通道的流入，与囊泡融合机制的其他成分合作，触发神经递质释放[2,3]。考虑到Ca的关键作用2＋控制神经递质释放的通道，突触前钙的表达、定位、结构或调节的缺陷2＋通道可能导致异常的突触信号，导致各种类型的神经网络功能障碍。据报道，Cav2.2通道影响多巴胺[4-6]、血清素[7]、谷氨酸[8]、γ -氨基丁酸[GABA]的释放;[9]，乙酰胆碱[10]和去甲肾上腺素[11]来自中枢神经元。
焦虑障碍(恐慌障碍/广场恐惧症、广泛性焦虑障碍、社交恐惧症和特定恐惧症)是最常见的精神疾病。焦虑症最有可能是由生物、心理和环境因素综合造成的。大多数患有这些疾病的人似乎对压力有生理上的脆弱性，使他们比其他人更容易受到环境刺激的影响。研究表明，某些神经递质之间的不平衡会导致焦虑症[12,13]。针对焦虑症的神经递质是多巴胺、血清素和氨基丁酸。血清素似乎在幸福感中特别重要，缺乏血清素与焦虑和抑郁高度相关[12,13]。因此，由于通过Cav2.2通道精确调节神经递质释放在神经回路的功能中起着重要作用，因此，Cav2.2介导的信号通路的改变会诱发焦虑和抑郁障碍。
在先前的研究中，接受脑室内注射ω-conotoxin GVIA(一种Cav2.2阻滞剂)的小鼠，在纹状体和额叶皮层[14]中显示出多巴胺和血清素的基线水平下降，并在抑郁行为测试[15]中显示出缺陷。然而，人们对Cav2.2在焦虑神经回路中的作用还知之甚少。焦虑行为通过高架加迷宫[16]、明暗探索[17]和大理石掩埋[18]行为测试进行评估。
在本研究中，为了研究cav2.2介导的信号传导与焦虑行为之间的关系，小鼠经i.c.v ω-conotoxin GVIA治疗后，采用升高+迷宫、明暗探索和大理石掩埋行为试验对其进行评估。
所有动物实验均经上海交通大学动物实验委员会和日本理化研究所批准。C57BL/6J小鼠由Charles River Japan(神奈川，日本)提供。这些小鼠被给予免费的水和食物颗粒(CRF-1;东方酵母有限公司，东京，日本)，并放置在12/12小时的明暗循环(从08:00到20:00亮灯)下，温度为23±1°C，湿度为55±5%。我们分别用两组两个月大的雄性小鼠进行每项行为测试。所有的实验都是在光照阶段进行的，研究人员对处理条件一无所知。
在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA (100 pg/μL, Peptide Institute, Osaka, Japan)溶解在生理盐水(载药)中。药物剂量的确定基于之前的报道[15,19,20]。对照组小鼠接受等量的载药。在麻醉下并使用标准立体定位程序，将不锈钢引导套管(22号)植入侧脑室(bregma后-0.34 mm;中线外侧，±0.9 mm;从硬脑膜腹侧，−2.3 mm)，术后允许小鼠恢复至少1周。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，以促进注射套管(26号)的插入。在行为测试前30min以0.05 μL/min的速度向侧脑室输注0.1 μL/侧。注射套管在注射后保持原位2分钟。
仪器由两个开口臂(L × W: 30 × 5cm)和两个开口臂(L × W × H: 30 × 5 × 15cm)组成，两个开口臂(L × W × H: 30 × 5 × 15cm)由一个共同的中央平台(L × W: 5 × 5cm)伸出。在张开的手臂周围有一个小凸起的嘴唇(0.3厘米)，防止老鼠摔倒。仪器由有机玻璃制成，有灰色的地板和墙壁，被抬高到地面以上45厘米。在每次实验开始时，一只老鼠被放在一个张开的手臂上，头部朝向中心平台。小鼠被允许在20勒克斯的光照下自由探索该装置10分钟。使用头顶摄像机记录小鼠的行为。手臂入水被定义为四条腿都进入其中一条手臂。测量双臂之间的过渡次数、进入张开双臂的次数以及在张开双臂中所花费的时间。
仪器由两个隔间组成:一个黑暗隔间(长×宽×高:15 × 10 × 20 cm)和一个光明隔间(长×宽×高:20 × 15 × 20 cm)。黑暗的隔间顶部有一个盖子，由黑色有机玻璃制成，而明亮的隔间在顶部是开放的，由白色有机玻璃制成。黑色树脂玻璃隧道(长×宽×高:10 × 7 × 4.5厘米)将暗箱和灯箱隔开。实验室内的光强为100勒克斯。一只老鼠被放在黑暗的隔间里，在10分钟的时间里用录像带记录下它的行为。测量了隔间之间过渡的次数和在照明隔间中花费的时间。四只爪子都在灯箱里的老鼠被认为完全在灯箱里。
小鼠分别被放置在透明聚碳酸酯笼子(长×宽×高:30 × 30 × 30 cm)中，笼子的壁上均匀地间隔着5厘米的木屑层和25个直径为2.5 cm的玻璃弹珠。将小鼠置于笼中，用摄像机记录埋弹行为20分钟。实验室内光照强度为50勒克斯。将至少三分之二的弹珠埋在木屑中，并对表现出弹珠埋埋行为的时间进行评估。
数据以均数±标准误差(SEM)表示。使用Excel Statistics 2006 (SSRI，东京，日本)进行统计分析。数据分析采用方差分析。Tukey的测试在适当的时候进行。在5%或更低的误差概率下，结果被认为是显著的。
本研究旨在观察静脉注射ω-螺毒素GVIA对焦虑行为的影响。两组雄性小鼠(n= 10例)分别进行对照剂或10 pg/side ω-conotoxin GVIA的i.c.v.注射。
在高架加迷宫中(图1)，注射了载体剂和注射了ω-锥体毒素的gvia小鼠的手臂入口的总数没有显著差异。静脉注射和注射ω-螺毒素gvia小鼠的张开臂条目数差异显著;注射ω-conotoxin gvia的小鼠与注射药物的小鼠相比，张开手臂的条目数明显减少。
数字1．高+迷宫。注射了载具-或ω-conotoxin gvia的小鼠被允许在迷宫中自由探索10分钟。计算进入迷宫的总数量(A)。进入张开手臂的数量表示为进入手臂总数量的百分比(B)。在张开手臂中停留的时间表示为进入手臂总时间的百分比(C)。数据表示为均值±标准误差(SEM)。＊P与适当对照相比< 0.05。
在明暗探索试验中(图2)，在注射了载体的小鼠和注射了ω-锥体毒素的gvia小鼠之间，明暗箱之间的过渡数量没有显著差异。静脉注射和注射ω-螺毒素gvia小鼠在灯箱中停留的时间有显著差异;注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在灯箱中的时间明显少于注射了药物的小鼠。
图2。昼夜的探索。灌胃剂注射小鼠或注射ω-锥体毒素gvia小鼠置于黑箱中10min。测量盒子之间的过渡次数(A)。在亮隔间中的时间表示为在亮隔间和暗隔间中的总时间的百分比(B)。数据表示为平均值±SEM。＊P与适当对照相比< 0.05。
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图3。大理石掩埋行为试验。将注射了载体剂或注射了ω-锥体毒素gvia的小鼠置于仪器中，并在20分钟内测量大理石掩埋行为。计算被埋弹珠的数量(A)。显示被埋弹珠行为的持续时间(B)。数据以平均值±SEM表示。＊P与适当对照相比< 0.05。
在埋弹试验中(图3)，注射ω-锥体毒素gvia的小鼠埋弹的数量大于注射车辆的小鼠埋弹的数量。注射ω-锥体毒素gvia的小鼠与注射载体的小鼠相比，在埋弹行为的持续时间上有明显的诱导作用。
神经元Cav2.2通道主要表达于整个中枢神经系统的突触前神经元末梢，并介导神经递质释放[1-3]。在我们之前的研究中，注射了Cav2.2阻滞剂ω-锥体毒素GVIA的小鼠，在纹状体和额叶皮层[14]中显示出多巴胺和血清素的基线水平下降。单胺的神经传递被认为可以控制情绪行为[6 - 11,21 - 24]。尽管情绪行为也可能是由其他神经递质系统介导的，但多巴胺和血清素水平的降低可能至少是情绪行为的部分原因。的确，ω-螺毒素gvia注射小鼠显示了影响抑郁机制[15]的神经网络的畸变。这些报告表明，Cav2.2通道功能障碍以及随后多巴胺和血清素释放的变化至少部分导致了抑郁行为的改变。然而，Cav2.2通道在焦虑神经回路中的作用尚未被研究。在本研究中，我们通过升高+迷宫、明暗探索和大理石埋埋行为试验，研究了静脉注射ω-conotoxin GVIA小鼠中cav2.2介导的信号传导与焦虑行为之间的关系。
在高架加迷宫试验中，注射ω-锥体毒素gvia的小鼠与注射药物的小鼠相比，在张开双臂的时间明显缩短。此外，注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在明暗探测和大理石埋藏试验中均表现出较高的焦虑程度。我们的结果表明，ω- cootoxin gvia注射小鼠表现出焦虑水平的增加，并且在cav2.2介导的神经回路异常有助于焦虑行为的基本病理生理机制。为了进一步研究Cav2.2通道依赖性信号传导如何影响焦虑相关行为，需要进行电生理学研究和神经递质释放分析。
Cav2.2通道敲除小鼠在亮期活性正常，在暗期[25]活性增强。在我们之前的研究中，开放场测试分析显示，车辆注射和注射ω-锥体毒素gvia小鼠[15]之间的运动活性没有显著差异。在本研究中，在高架加迷宫试验中，ω-锥体毒素GVIA注射小鼠和灌药小鼠的手臂条目总数没有显著差异。在明暗探索测试中，两组小鼠在明暗盒子之间的过渡次数没有显著差异。这些结果表明，至少在光阶段，Cav2.2通道依赖性信号通路对自发活性没有影响。
在目前的研究中，我们发现特异性的Cav2.2阻断剂ω-conotoxin GVIA抑制Cav2.2介导的信号传导，可诱导小鼠在升高+迷宫、明暗探索和大理石掩埋行为测试中出现焦虑相关的行为缺陷。先前的研究结果表明，cav2.2介导的信号通路与多巴胺能和血清素能系统[14]以及cav2.2介导的信号通路与抑郁相关行为[15]的表达之间存在显著的关系。这些发现表明，抑制Cav2.2介导的信号传导可诱导情绪变化，这是由于与Cav2.2功能障碍相关的神经回路系统的改变所致。
本研究得到国家973项目(2010CB529604)和国家科学基金项目(81271511和30900432)的资助。
作者声明没有竞争利益。
WL和ET设计和监督了研究，并撰写了手稿。YZ和KN分别进行手术和行为实验。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。
音)山口
埃默里大学医学院
研究文章
收稿日期:2015年12月10日
录用日期:2015年12月24日
出版日期:2015年12月28日
©2016 Zhou Y.这是一篇基于创作共用署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
周颖，Niimi K, Li W, Takahashi E(2016)焦虑神经回路中cav2.2介导的信号传导。整合分子医学3:DOI: 10.15761/ im .1000193。
日本理研脑科学研究所研究资源中心，埼玉县和库市广泽2-1，邮编351-0198，电话:+81-48-467-5871;传真:+ 81-48-467-9692
数字1．高+迷宫。注射了载具-或ω-conotoxin gvia的小鼠被允许在迷宫中自由探索10分钟。计算进入迷宫的总数量(A)。进入张开手臂的数量表示为进入手臂总数量的百分比(B)。在张开手臂中停留的时间表示为进入手臂总时间的百分比(C)。数据表示为均值±标准误差(SEM)。＊P与适当对照相比< 0.05。
图2。昼夜的探索。灌胃剂注射小鼠或注射ω-锥体毒素gvia小鼠置于黑箱中10min。测量盒子之间的过渡次数(A)。在亮隔间中的时间表示为在亮隔间和暗隔间中的总时间的百分比(B)。数据表示为平均值±SEM。＊P与适当对照相比< 0.05。
图3。大理石掩埋行为试验。将注射了载体剂或注射了ω-锥体毒素gvia的小鼠置于仪器中，并在20分钟内测量大理石掩埋行为。计算被埋弹珠的数量(A)。显示被埋弹珠行为的持续时间(B)。数据以平均值±SEM表示。＊P与适当对照相比< 0.05。
