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摘要

Cav2.1和Cav2.2通道主要表达于突触前神经末梢，介导中枢神经系统神经递质释放。尽管有报道称，空间学习需要伏隔核(NAc)中cav2.1调节的信号传导，但cav2.2调节的功能仍不清楚。在本研究中，我们研究了NAc中cav2.2介导的信号通路是否在Y迷宫试验的自发交替模式中起作用。伏隔内注射Cav2.2阻滞剂(ω-conotoxin GVIA, 5pg/side)的小鼠自发交替模式受损。我们的研究结果表明，伏隔核中cav2.2介导的信号传导对空间认知也至关重要。

关键字

Cav2.2，伏隔核，神经元回路，ω-Conotoxin GVIA, Y迷宫试验

简介

据报道，在几种认知活动中，来自海马体和前额皮质的谷氨酸输入为伏隔核(NAc)提供了主要的信息来源[1-5]。电压门控钙通道(电压门控钙通道，VGCCs)通过神经递质释放、神经元兴奋、神经突生长、突触发生、神经元存活、分化、可塑性和基因表达调控等多种神经元功能控制神经元回路[6-8]。神经元VGCCs包括Cav2.1 (P/ q型)和Cav2.2 (n型)通道，主要表达于中枢神经系统的突触前神经元末梢。有文献报道谷氨酸能系统是受Cav2.1和Cav2.2调控的神经递质系统之一[9,10]。不同vgcc在空间短时记忆神经回路中的作用尚未被研究。一个有趣的问题是，在操纵不同的通道信号后，观察到的效果是否存在差异。研究不同的通道阻滞剂和局部注入将有助于诱导短期空间学习的效果，并有助于确定特定神经元回路中的功能信号通路。

我们已经证明，cav2.1调节的海马[11]和NAc[12]中的谷氨酸信号在短期空间学习中很重要。我们还证实了海马cav2.2调节信号在空间短期记忆[13]中的重要性。先前的报道表明，Cav2.1和Cav2.2在海马体和参与空间短期记忆形成的NAc[14]中高浓度存在。Cav2.2通道在多种功能神经元电路系统中起作用[6,13]。这些结果表明，Cav2.2在NAc中也起着重要作用。然而，cav2.2调节的认知能力在NAc中的生理作用尚未确定。

为了研究Cav2.2介导的突触传递与空间短期记忆之间的关系，我们在NAc中使用了Cav2.2抑制剂ω-conotoxin GVIA的小鼠进行了Y迷宫实验。本文的研究证明了cav2.2介导的认知信号在NAc中的重要性。

材料和方法

老鼠

所有动物实验均经上海交通大学动物实验委员会和日本理化研究所批准。C57BL/6J小鼠由Charles River Japan(神奈川，日本)提供。这些小鼠被给予免费的水和食物颗粒(CRF-1;东方酵母有限公司，东京，日本)，并放置在12/12小时的光/暗循环(从08:00到20:00亮灯)下，温度为23±1^°湿度55±5%。测试在循环的轻阶段进行。我们分别用两组2个月大的雄性小鼠进行每项行为测试。所有实验均对小鼠的处理条件进行盲法处理。

Y迷宫测试

Y迷宫测试在10点到16点之间进行，由一名训练有素的实验人员进行，但对小鼠品系一无所知。实验前至少2小时将小鼠转移到行为试验室。y形迷宫装置由三个从中心向外辐射的隔间组成(3厘米宽× 40厘米长× 25厘米高)。在注射前，小鼠被放置在其中一个隔间中，并允许自由活动10分钟。实验室内的光强为35勒克斯。手臂条目被定义为三条腿进入其中一条手臂，条目的顺序被手动记录。每只老鼠进行一次试验。改变被定义为在连续的选择中全部进入三个臂。自发蚀变百分比计算为(实际蚀变/最大蚀变)× 100。在海马内注射实验完成后，在光镜下检查fronzen脑切片。注射针放置在靶区边界之外的小鼠被排除在行为分析之外。

输液

在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂、ω-conotoxin GVIA(10,50，或100 pg/μL, Peptide Institute, Osaka, Japan)溶解在生理盐水(载药)中。在麻醉下并使用标准立体定位程序，将不锈钢引导套管(22号)植入NAc(胸骨前方+1.7 mm;中线外侧，±1.0 mm;硬脑膜腹侧，+2.3 mm)。小鼠术后至少恢复1周。药物剂量的确定参照既往报道[13,15]。未接受药物治疗的小鼠获得了等量的载药量。

组织学

在行为测试结束时对插管位置进行组织学验证。小鼠经心静脉灌注0.9%生理盐水，再灌注4% PFA。从颅骨中取出后，将大脑固定在4%的PFA中，然后转移到30%的蔗糖溶液中，直到切片。冠状切片(40 μm厚，每120 μm取一次)在低温恒温器(-16℃)上切割，安装在玻璃载玻片上。干燥后，切片用甲酚紫染色。

数据分析

数据以均数±标准误差(SEM)表示。使用Excel统计2006 (SSRI，东京，日本)对行为测试进行统计分析。数据分析采用重复测量方差分析与Tukey检验。

结果

为了检验伏隔内药物注射对y迷宫空间短期记忆的影响，我们使用了四组雄性小鼠(n= 10)伏隔内注射0(对照剂)，1,5或10 pg/side ω-conotoxin GVIA。各组间臂条目数无显著差异[F(3,36) = 1.2, P > 0.05](图1A)。但两组在自发性改变方面差异有统计学意义[F(3,36) = 111.5, P < 0.01](图1B)。给药5或10 pg/ side ω-conotoxin GVIA的小鼠比给药的小鼠表现出较少的改变。图2显示了NAc中有代表性的输液管位置。这些结果表明，阻断cav2.2介导的nac依赖性信号通路会损害短期记忆。

图1所示。伏隔内注射ω-锥体毒素GVIA对y迷宫试验中总臂条目数(A)和自发改变数(B)的影响。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。** P与适当对照组比较< 0.01 (Tukey’s检验)。

图2。这张冠状图显示了针对伏隔核(NAc)注射的ω-锥体毒素GVIA的位置。

讨论

在之前的研究中，我们已经证明脑室内或海马内注射左乙拉西坦Cav2.1阻滞剂可以阻断自发改变行为[11]。我们还发现脑室内或海马内注射ω-conotoxin GVIA的Cav2.2阻滞剂可以阻断[13]的自发改变行为。这些结果表明，由Cav2.1和Cav2.2激活的海马信号级联在空间短时记忆中起作用。包括Cav2.1和Cav2.2通道在内的神经元VGCCs在海马和参与短时记忆形成的NAc[14]中均以高浓度表达为主[1-5]。事实上，NAc中cav2.1调控的信号在空间记忆形成[12]中也很重要。然而，NAc中cav2.2介导的信号通路与短期记忆形成之间的关系尚未得到研究。在本研究中，我们研究了ω-锥体毒素GVIA伏隔内注射是否会干扰自发改变行为。

本研究显示，伏隔区内注射Cav2.2阻滞剂的小鼠自发交替模式受损。虽然我们需要电生理和生化研究来检验钙^{2 +}我们的研究结果表明，海马和NAc是空间记忆形成的重要区域，区域内的空间信息是通过Cav2.2调节的传输处理的。

在y -迷宫实验中，NMDA受体拮抗剂损害小鼠的自发交替[16-19]，而NMDA受体激动剂增强了在这类记忆任务中的表现[11]。此外，在短期版Morris水迷宫测试[20]中，局部伏隔内给药NMDA拮抗剂会损害小鼠定位隐藏平台的能力。这些结果表明NAc内的NMDA受体信号通路与短期空间记忆有关。电生理学研究表明Ca^{2 +}在分离的NAc[21]中发现通过Cav2.1的电流。杂合的滚动Cav2.11突变的名古屋(rol/+)小鼠表现出正常的y -迷宫行为[12]。在我们之前的研究中，尽管伏隔内注射NMDA在野生型和rol/+小鼠中诱导了类似的自发变化，但注射NMDA受体拮抗剂MK-801 (0.5 μg/侧)或Cav2.1抑制剂左乙拉西坦(0.1g/侧)对对照组没有影响，但在rol/+小鼠[12]中降低了空间认知能力。这表明NAc中cav2.1介导的NMDA受体信号通路参与短期空间学习，低于阈值剂量的药物组合可能有助于诱导沉默突变体的表型和识别功能信号通路。有报道称谷氨酸能系统是受Cav2.2调控的神经递质系统之一[9,10]。因此，在NAc中注入Cav2.2阻滞剂和谷氨酸能化合物的小鼠可能是描述与Cav2.2介导的NMDA受体信号转导相关的空间记忆形成机制的有用模型。

综上所述，我们发现伏隔区内给药Cav2.2阻滞剂扰乱了Y迷宫试验的自发交替行为。我们的研究结果表明，伏隔核中cav2.2介导的信号通路在空间短期记忆中具有重要作用。

的利益冲突

作者声明没有竞争利益。

作者的贡献　

WL和ET设计和监督了研究，并撰写了手稿。YZ和KN分别进行手术和行为实验。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。

参考文献

2021年版权燕麦。所有权利reserv

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