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抽象的

神经元电压门控钙通道（VGCC）因其在特定电路中的突触传递和信号通路中的重要性而闻名。另一方面，不同VGCC在认知功能中的作用尚未研究。尽管有报道称恐惧消除需要Cav2.1调节的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体信号，Cav2.2调节的突触功能在灭绝中仍然未知。本研究检测了Cav2.2介导的信号是否在灭绝巩固中发挥作用。小鼠接受侧脑室注射Cav2.2阻断剂（ω-芋螺毒素GVIA，5 pg/侧）在内侧前额叶皮质（mPFC）中，CREB依赖性基因Arc的表达降低。mPFC内注射ω-芋螺毒素GVIA（5 pg/中线）可阻断灭绝。这些结果表明，Cav2.2介导的信号传导在mPFC依赖性恐惧消退中起关键作用。

关键词

Cav2.2，恐惧消除，神经元回路，ω-芋螺毒素GVIA

介绍

灭绝程序不会删除原始恐惧记忆，但产生了一种新的安全存储器，可在某些条件下抑制恐惧[1]。动物学会在恐惧调理期间将先前中性或条件刺激（CS）与厌恶或无条件的刺激（US）相关联。随后独自地重新接触到CS触发了两个竞争程序。短暂的重新接触CS启动重新掩盖过程，用于稳定或维持原始的CS-US记忆[2]。相比之下，更长时间的再暴露于CS导致形成抑制灭绝（CS-NO）记忆[3]。了解恐惧灭绝的神经电路机制很有意思。

Ca²⁺通过电压门控钙通道（VGCC）的信号传导介导Ca²⁺响应膜进入细胞去极化神经VGCC包括Cav2.1（P/Q型）、Cav2.2（N型）和Cav2.3（R型）通道介导许多神经元功能，包括神经元兴奋、神经突起生长、，Synaptogenesis.,神经递质释放、神经元存活、分化、可塑性和基因表达调控[4-6]。另一方面，不同VGCC在恐惧消除神经回路中的作用尚未研究。

Cav2.1通道介导谷氨酸释放的突触前机制[7]。Cav2.1和NMDA受体广泛表达于中枢神经系统[8-11]。此前的一项研究报告称，恐惧消除需要大脑中的分布式神经回路，特别是内侧前额叶皮质（mPFC）[12,13].阻断mPFC中的蛋白质合成可防止灭绝记忆的形成，并且在灭绝巩固阶段，mPFC中诱导激活cAMP响应元件结合蛋白（CREB）介导的转录[14].我们之前的研究表明，Cav2.1调节的mPFC中的NMDA受体信号调节与灭绝记忆有关的CREB级联[15]。服用Cav2.1阻断剂可导致功能失调的恐惧消退[15]然而，Cav2.2调节的灭绝的生理作用尚未确定。Cav2.2在中枢神经系统中也广泛表达[8]因此，服用Cav2.2阻滞剂会导致功能失调的恐惧消除，因为通过Cav2.2精确调节神经递质释放在神经元回路中也起着重要作用[4-6]。

人们对消除恐惧的神经机制越来越感兴趣[16,17]在本研究中，为了研究mPFC中Cav2.2介导的信号传导与灭绝记忆形成之间的关系，我们使用接受侧脑室或mPFC内注射的野生型小鼠研究了条件性恐惧的消失在Cav2.2阻断剂（ω-芋螺毒素GVIA）的研究中，我们使用免疫组织化学分析来描述Cav2.2介导的信号传导与CREB依赖性基因活性调节的细胞骨架相关蛋白（Arc）表达之间的关系在长时间的再暴露后。这里的研究证明了mPFC依赖的Cav2.2介导的信号在巩固恐惧消除中的重要性。

材料和方法

老鼠

所有动物实验程序均经上海交通大学动物实验委员会和日本理研大学批准。C57BL/6J小鼠由日本神奈川Charles River公司提供。小鼠可自由饮用水和食物颗粒（CRF-1；日本东京东方酵母有限公司），并在12/12小时的光/暗循环中饲养在23±1°C和55±5%湿度条件下（从08:00到20:00亮起）。在周期的光照阶段进行测试。所有实验均在对小鼠治疗条件不知情的情况下进行。

情境恐惧条件作用

小鼠在具有不锈钢杆地板的调节室（17.5×17.5×15 cm）中进行训练和测试，通过不锈钢杆地板可以传递足部电击（美国VT圣奥尔本斯市Med Associates，Inc.）。训练包括将小鼠放置在调节室中，并以1分钟的间隔传递一系列未标记的三次足部电击（在放置于试验箱后148 s进行第一次足部电击）。在最后一次足部电击后30 s，将小鼠返回其家中笼子。训练24小时后，将小鼠再次暴露于条件反射环境中30 min。在绝育期后的一天，对小鼠进行测试（5 min）.自动测量冻结行为（Winroof 5.5版软件；日本东京三谷公司）。

灌注

在输注研究中，Cav2.2阻滞剂ω-芋螺毒素GVIA（10、50或100 pg/μL，日本大阪肽研究所）溶解在盐水（载体）中。在麻醉下，使用标准立体定向程序，将不锈钢导管（22号）植入侧脑室（布雷格玛后方，-0.34毫米；中线外侧，-0.9毫米；硬脑膜腹侧，−2.3 mm）或mPFC（短颅前方+1.9 mm；中线外侧±0 mm；硬脑膜腹侧，−2.3 mm）。手术后让小鼠至少恢复1周。用异氟醚短暂麻醉小鼠，以便于插入注射套管（26号）。向侧脑室（0.1μL/侧）或mPFC（0.1μL/中线）注入，包括边缘前皮质（PLC）和边缘下皮质（ILC）再次暴露后立即以0.05μL/min的速率完成。输注后将注射套管留在原位2 min。根据先前的报告[15,18]确定药物剂量。未使用药物治疗的小鼠接受等量的载体。

免疫细胞化学

在再暴露会议后90分钟在重新暴露会议后立即接受脑室内注射的小鼠并用含有4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水（PBS）/ 0.1mM氟化钠（NAF）灌注。然后除去大脑，固定过夜，并转移到30％蔗糖中。在低温恒温器上切割冠状切片（30μm）。将连续的部分用抗弧兔多克隆原代抗体（1：1,000; Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA，USA）孵育过夜。将这些部分与生物素化的山羊抗兔IgG（SAB-PO套件; Nichirei Biosciences，东京，日本）一起温育，然后在室温下在链霉抗生物素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物（SAB-PO试剂盒）中孵育。用计算机化图像分析系统（Winroof 5.5软件）测定PLC和ILC的弧形阳性细胞的定量（2.00和1.88 mm之间）的弧形阳性细胞。免疫反应性神经元用两侧（200×200μm）的固定样品窗口，通过实验者对治疗条件视而不见。

数据分析

数据以平均值±平均值标准误差（SEM）表示。使用Excel Statistics 2006（SSRI，日本东京）对行为和免疫细胞化学研究进行统计分析。使用重复测量方差分析（ANOVA）对数据进行分析，然后进行Tukey的事后测试。

结果

侧脑室注射ω-芋螺毒素GVIA对冷冻率的影响

我们研究了侧脑室注射ω-芋螺毒素GVIA对灭绝巩固的影响。我们的实验设计如图1A所示。我们使用了四组雄性小鼠（每组n=10），给予全身注射0（溶媒），1，5，或10 pg/侧ω-芋螺毒素GVIA。在灭绝训练课程中，各组之间没有显著差异[F（15216）=0.8，P>0.05]（图1B）。但是，在试验期间，各组的冷冻百分比存在显著差异[F（3，36）=155.7，P<0.01]（图1C）。给予5或10 pg/侧ω-芋螺毒素GVIA的小鼠比给予载体的小鼠表现出更大的冷冻行为。这些结果表明，阻断Cav2.2介导的信号会损害灭绝的巩固。实验后通过墨水注射验证了引导套管的正确放置（数据未显示）。

图1。ω-conotoxin GVIA侧脑室注射对冻结率的影响。使用(A)所示的实验设计来收集以下数据。ω-conotoxin GVIA对冻结率的影响表现在消光训练阶段(B)和试验阶段(C)P<0.01，与适当的对照组比较（Tukey试验）。

ω-conotoxin gvia对MPFC弧形表达的脑内注射效应

侧脑室注射研究难以评估级联反应在大脑中的作用部位。因为之前的研究报道恐惧消除需要mPFC中CREB的表达[14]，我们用小鼠研究了Arc的表达模式(n =4）在再次暴露后立即注射溶媒或5 pg/侧ω-芋螺毒素GVIA。实验设计如图2A所示。所有组在30 min的再次暴露期间显示出冷冻水平下降[F（5,84）= 0.7，P> 0.05]. 再暴露90分钟后，与注射ω-芋螺毒素GVIA的小鼠相比，在注射载体的小鼠的mPFC区域，包括前肢皮质（PLC）和边缘下皮质（ILC）中检测到显著更高的Arc表达[PLC:F(14) = 84.6,P<0.01，国际劳工公约：F(1,14)=20.2,P<0.01]（图2B和2C）。这些结果表明，mPFC中Cav2.2介导的信号传导对于巩固灭绝是必要的。

图2。侧脑室注射ω-芋螺毒素GVIA对Arc表达的影响。使用（A）所示的实验设计收集以下数据。mPFC中的Arc表达量，包括边缘前皮质（PLC）和边缘下皮质（ILC），是相对于溶媒注射小鼠体内存在的Arc量计算的（B）；PLC和ILC中的代表性免疫细胞化学显示（C）。定量基于五个独立实验的平均值**P<0.01与适当的对照（Tukey试验）进行比较。比例尺，50μm。

mPFC内注射ω-芋螺毒素GVIA对冷冻率的影响

我们检查了mPFC内注射ω-芋螺毒素GVIA对灭绝巩固的影响。我们的实验设计如图3A所示。我们使用了四组雄性小鼠(N=10）给予全身注射0（溶媒）、1、5或10 pg/中线ω-芋螺毒素GVIA。各组在消退训练课程中没有显著差异[F(15, 216)=0.8,P> 0.05]（图3B）。然而，在测试期间，这些组的百分比显着不同[F(3, 36)=146.9,P<0.01]（图3C）。图3D显示了mPFC中的输液套管放置，包括PLC和ILC。给予5或10 pg/中线ω-芋螺毒素GVIA的小鼠比给予载体的小鼠表现出更大的冷冻行为。这些结果表明，阻断mPFC中Cav2.2介导的信号会损害灭绝的巩固。

图3。mpfc内注射ω-conotoxin GVIA对冻结率的影响。使用(A)所示的实验设计来收集以下数据。在消光训练阶段(B)和测试阶段(C)显示了ω-conotoxin GVIA对冻结率的影响。这张冠状图显示了针对mPFC注射的ω-conotoxin GVIA的位置，包括边缘前皮层(PLC)和边缘下皮层(ILC) (D)。**P<0.01，与适当的对照组比较（Tukey试验）。

讨论

灭绝研究的一个主要目标是了解灭绝经历每个阶段的分子和电路机制。先前使用NMDA受体拮抗剂进行的研究表明，NMDA受体在灭绝训练期间（灭绝获得）不是必需的，但对于长期保留灭绝（灭绝巩固）是必需的[19,20]。据报道，Cav2.1阻滞剂抑制谷氨酸能突触传递[17,21]和灭绝巩固（即，在灭绝训练后）[15]。据报道，ω-芋螺毒素GVIA抑制突触前Cav2.2功能[15]，并减少谷氨酸释放[21]。不同VGCC在认知功能中的作用尚未研究。因此，我们检测了Cav2.2介导的信号传导是否对灭绝的巩固很重要

我们发现，ω-conotoxin GVIA侧脑室注射阻断了灭绝记忆，表明Cav2.2激活的信号级联在灭绝记忆的巩固中发挥了作用。由于Cav2.2通道存在于各种突触[8]中，因此脑室内注射研究不可能确定参与消退记忆形成的特定脑区。在这方面，研究特定神经区域的表达和微灌注将有助于阐明相关的神经元机制。

在消退期[14]的巩固过程中，mPFC中可诱导creb介导的转录激活。以往的报道表明，mPFC是在消光训练发生后发生的[22-25]。我们的结果表明，在再次暴露后立即侧脑室注射ω-conotoxin GVIA阻断了Arc在mPFC中的表达。结果表明，mPFC是湮灭记忆形成的重要区域，特别是在湮灭阶段的巩固过程中，mPFC内的信息可能被cav2.2调控的传输处理。事实上，目前的研究表明，在mPFC中阻断cav2.2调节的信号会导致功能失调的恐惧消退。这些结果表明，通过整合不同输入源和mPFC之间的关系，在mPFC中cav2.2介导的信号通路在消光训练后获得一个重要的消光体验方面发挥了重要作用。这反过来又有助于改变行为策略，在灭绝检索过程中迅速抑制先前习得的恐惧反应。在mPFC中，PLC和ILC与恐惧[26]的表达有关，而在巩固阶段的消退记忆形成与PLC和ILC[14]的激活神经元功能有关。PLC主要投射到参与恐惧表达的兴奋性神经元[27-29]，而ILC主要投射到参与消退后抑制恐惧的抑制性神经元[30-32]。微输注NMDA受体拮抗剂或GABA_A.受体激动剂会损害灭绝记忆[24,33]，而GABA_A.受体拮抗剂促进灭绝记忆[34]。这些结果表明，mPFC内的谷氨酸能和GABA能突触传递都有助于灭绝学习。据报道，Cav2.2介导谷氨酸能[35]和GABA能[36]突触传递。在本研究中，注射ω-芋螺毒素GVIA的小鼠的PLC和ILC中的神经元活性均降低。尽管mPFC内以及mPFC与其他区域之间的灭绝学习和回忆神经回路机制的直接证据尚待检验，但这些信息将有助于理解研究导致精神病理学的灭绝障碍的性质和原因。

在本研究中，我们发现Cav2.2介导的信号传导对mPFC依赖的条件性恐惧消退行为的巩固至关重要。但是，我们没有研究Cav2.2介导的信号传导与谷氨酸能系统、Cav2.2介导的信号传导与GABA能系统之间是否存在关系，以及甚至Cav2.1介导的信号转导和Cav2.2介导的消失记忆信号转导。我们计划确定恐惧消失的特定神经回路中的功能性信号通路。

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

作者的贡献　

WL和ET设计和监督了这项研究，并写了稿件。YZ和KN表现了行为和生化实验。所有作者都阅读并批准了稿件的最终版本。2021版权燕麦。保留所有权利

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