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摘要

包括Cav2.2在内的神经电压门控钙通道(VGCCs)介导神经递质的突触前释放机制。Cav2.2在抑郁症神经回路中的作用仍不清楚。在本研究中，脑室内注射Cav2.2抑制剂ω-conotoxin GVIA (5 pg/side)可增加小鼠在强迫游泳和尾悬试验中的抑郁样行为。这些结果表明，cav2.2介导的信号通路在抑郁行为中起作用。

关键字

Cav2.2，抑郁，强迫游泳试验，ω-Conotoxin GVIA，尾悬试验

简介

电压门控钙^２＋(Cav)通道在调节细胞内钙含量升高引起的各种神经元功能中起着重要作用^２＋浓度[1,2]。Cav通道是由α1、β、α2-δ和γ亚基[1]组成的分子络合物。α1亚基对通道功能至关重要，决定了通道的基本性质[1]。编码10个孔形成α1亚基和几个剪接变异体的基因已被鉴定并鉴定为[3]。

在突触前末端，Cav2.2 (N型)通道介导Ca^２＋依赖神经递质[4]的胞外释放。Ca^２＋涌入通过这些通道与囊泡融合机制的其他成分[5]协同作用，触发神经递质释放。考虑到Ca的关键作用^２＋控制神经递质释放的通道，突触前钙的表达、定位、结构或调节的缺陷^２＋通道可能导致异常的突触信号，导致各种类型的神经网络功能障碍。据报道，Cav2.2通道影响多巴胺的释放[DA;6-8]，血清素[5-HT;9]，谷氨酸[10]，-氨基丁酸[11]，乙酰胆碱[12]和去甲肾上腺素[NE;13]来自中枢神经元。就临床相关性而言，神经递质失衡与抑郁症[14]密切相关。根据单胺假说，抑郁症可归因于主要单胺类神经递质(DA、5-HT和NE)的缺乏。由于Cav2.2通道参与神经递质释放的调节，使用Cav2.2阻滞剂有望导致抑郁行为。

在接受了ω- cootoxin GVIA(一种Cav2.2抑制剂)脑室内注射的小鼠中，纹状体和额叶皮层[15]中DA和5-HT的基线水平降低。通过强制游泳测试[16]和尾悬测试[17]，Cav2.2抑制剂也能诱导抑郁行为。

本研究进一步探讨了cav2.2介导的信号转导与抑郁之间的关系。小鼠经腹腔注射ω-螺毒素GVIA治疗，采用强迫游泳和尾悬试验评估抑郁。

材料与方法

老鼠

所有动物实验均经上海交通大学动物实验委员会和日本理化研究所批准。C57BL/6J小鼠由Charles River Japan(神奈川，日本)提供。这些小鼠被给予免费的水和食物颗粒(CRF-1;东方酵母有限公司，东京，日本)，并放置在12/12小时的明暗循环(从08:00到20:00亮灯)下，温度为23±1°C，湿度为55±5%。我们分别用两组两个月大的雄性小鼠进行每项行为测试。所有的实验都是由对光相处理条件不知情的研究人员进行的。

输液

在输注研究中，将Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA (100 pg/μL, Peptide Institute, Osaka, Japan)溶解在生理盐水(载药)中。药物剂量的确定基于之前的报道[15,18,19]。未治疗的小鼠接受等量的载药。在麻醉下并使用标准立体定位程序，将不锈钢引导套管(22号)植入侧脑室(bregma后-0.34 mm;中线外侧，±0.9 mm;从硬脑膜腹侧，−2.3 mm)，术后允许小鼠恢复至少1周。用异氟醚对小鼠进行短暂麻醉，以促进注射套管(26号)的插入。在行为测试前30min以0.05 μL/min的速度向侧脑室输注0.1 μL/侧。注射套管在注射后保持原位2分钟。

露天试验

将动物置于透明树脂玻璃箱中(长×宽×高:30 × 20 × 15 cm)，测量运动活性。然后将盒子放置在红外光束(Scanet SV-10，东京，日本)安装的框架上。实验室内的光强为60勒克斯。光束中断时间为20分钟。

尾部测试

仪器为长×宽×高15.0 × 16.0 × 25.0 cm的非透明隔室，带钩(长4.0 cm)。吊钩与地面的距离为21厘米。用胶带将每只老鼠挂在距其尾巴末端2cm处的钩子上，用摄像机记录其行为7min^nd和7^th实验室内的光强为150勒克斯。记录的参数是静止不动的总时间。

强迫游泳测验

每只老鼠被放置在一个19厘米(直径11.0厘米)的玻璃缸中，缸中有13厘米的水，温度为23±1°C。当一只老鼠浮在水面上，它的后肢静止不动，只有前爪的微小动作才能使头部露出水面时，它就被认为是静止不动的。实验室内的光强为150勒克斯。用摄像机记录下7分钟的行为^nd和7^th记录的参数是静止不动的总时间。

组织学

在行为测试结束时对插管位置进行组织学验证。小鼠经心静脉灌注0.9%生理盐水，然后注入4%多聚甲醛(PFA)。颅骨取出后，将大脑固定在4%的PFA中，然后转移到30%的蔗糖溶液中，直到切片。冠状切片(40 μm厚，每120 μm取一次)在低温恒温器(-16℃)上切割，安装在玻璃载玻片上。干燥后，切片用甲酚紫染色。

行为结果的统计分析

数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。使用Excel Statistics 2006 (SSRI，东京，日本)进行统计分析。数据采用方差分析(ANOVA)进行分析。Tukey的测试在适当的时候进行。在5%或更低的误差概率下，结果被认为是显著的。

结果

本研究考察了ω-螺毒素GVIA对抑郁行为的影响。两组雄性小鼠分别静脉注射ω-螺毒素GVIA (5 pg/side)或对照剂。

在开放场地试验中，注射了ω-螺毒素gvia的小鼠和注射了ω-螺毒素gvia的小鼠在运动活动方面没有观察到显著差异(图1)。在尾悬和强迫游泳试验中，注射了ω-螺毒素gvia的小鼠的静止时间明显比注射了ω-螺毒素gvia的小鼠长(图2和图3)。

图1所示。露天试验。载体注射或注射ω-Conotoxin gvia小鼠(n=每人10人)被允许自由探索20分钟。

图2。尾悬试验。载体注射或注射ω-Conotoxin gvia小鼠(n=每只10只)被吊在尾部。在2^nd到7^th分钟。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。

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图3。强迫游泳测试。载体注射或注射ω-Conotoxin gvia小鼠(n= 10个)在器械中释放，并评估2^nd到7^th分钟。数据以均数±标准误差(SEM)表示。**P与适当对照相比<0.01 (Tukey’s检验)。

注射针放置在靶区边界之外的小鼠被排除在行为分析之外(数据未显示)。

讨论

单胺的神经传递被认为控制着情绪行为。目前抑郁症的生物学研究涉及神经递质、激素和维生素代谢的多个方面，单胺类神经递质代谢是40多年来研究的一个主要领域[20-23]。神经元Cav通道，包括Cav2.1和Cav2.2，主要表达于整个中枢神经系统的突触前神经元末梢[9]。Cav通道调节抑郁相关神经递质的释放;然而，不同的Cav通道，特别是Cav2.2，在抑郁症的神经回路中的作用尚未被探索。在目前的研究中，我们研究了Cav2.2介导的信号传导与小鼠的抑郁之间的关系，这些小鼠在i.c.v.注射了Cav2.2阻滞剂ω-conotoxin GVIA。

我们首先检查了ω- cootoxin GVIA对运动活动的影响，通过评估在强迫游泳和尾巴悬挂试验中的不动。开放场试验显示，注射车辆和注射ω-锥体毒素gvia小鼠的运动活性无显著差异。在之前的一项研究中，我们使用活动轮测试[24]检查了Cav2.2通道功能的细微中断对电机活动的影响。Cav2.2通道敲除小鼠在亮期活性正常，在暗期活性增加。在本研究中，在光阶段进行，Cav2.2通道依赖性信号对小鼠自发活动没有影响。在强迫游泳和尾悬试验中，注射ω-螺毒素gvia的小鼠静止时间显著延长(也就是说,增加抑郁样行为)。总之，结果表明，Cav2.2通道依赖性信号通路对抑郁行为有影响。

在我们之前的研究中，ω-锥体毒素GVIA[15]引起小鼠纹状体和额叶皮层DA和5-羟色胺的基线水平降低。尽管情绪行为可能受到多种神经递质系统的影响，但我们的研究结果表明，Cav2.2通道功能障碍以及随后DA和5-HT的下降可能至少部分导致了ω-conotoxin gvia注射小鼠的抑郁行为。

综上所述，特异性的Cav2.2阻断剂ω-conotoxin GVIA抑制Cav2.2介导的信号传导可导致强迫游泳和尾悬试验中的行为缺陷。由于Cav2.2影响DA和5-HT[15]的释放，因此Cav2.2介导的信号转导异常可能在抑郁症的病理生理机制中发挥作用。额外的神经递质释放电生理学研究将有助于阐明Cav2.2信号通路与抑郁症之间的关系。

致谢

本研究得到国家973项目(2010CB529604)和国家科学基金项目(81271511和30900432)的资助。

利益冲突

作者声明没有竞争利益。

作者的贡献

WL和ET设计和监督了研究，并撰写了手稿。YZ和KN分别进行手术和行为实验。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。

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