生物科学研究所，联邦大学Goiás, UFG, GO，巴西
DOI: 10.15761 / VDT.1000166
动脉粥样硬化是一种以慢性炎症为特征的心血管疾病。该疾病与中、大口径动脉内膜内脂肪酸的积累密切相关。疾病的发展与血管和免疫系统稳态的改变有关。免疫细胞的作用使炎症过程加剧。这种疾病的诊断在大多数情况下是侵入性的。因此，需要新的诊断和治疗技术，并可提高动脉粥样硬化患者的生活质量。的以挪士基因是一种有效的心血管疾病的生物标志物，包括动脉粥样硬化、脑卒中和心肌梗死。的以挪士基因及其编码的蛋白质控制着一氧化氮的产生。这种化合物参与多种生物功能，它的作用对保护动脉免受损伤至关重要。在这里,一个in-silico我们设计了两个小活性肽，以稳定eNOS，并保证其正常的一氧化氮生产功能水平。我们假设，使用设计的肽可以作为他汀类药物(如阿托伐他汀)的替代品，对动脉粥样硬化患者产生有效的治疗，且副作用较少或无副作用。为了未来的展望，一种调制肽的测定方法正在设计中在体外而且在活的有机体内以便有可能被用作一种新的治疗剂。
eNOS，动脉粥样硬化，生物信息学，调节肽
动脉粥样硬化是一种世界范围内常见的疾病，其特征是由于脂肪酸在内膜内积聚而引起的慢性炎症过程。该病通过血小板因子、脂肪酸、免疫系统和平滑肌细胞的积累和沉积，导致动脉粥样硬化斑块的形成。这种因素的直接后果是动脉腔变窄。最终，动脉粥样斑块发生纤维化和钙化，随着时间的推移可能导致严重的症状，甚至死亡[1]。
动脉粥样硬化的发生取决于血管和免疫系统稳态的改变。来自免疫系统的细胞影响疾病的发病机制，加重内皮细胞[3]内的炎症过程。动脉粥样硬化是一种隐性疾病，受遗传、生理和环境因素[4]的影响，需要较长时间才能表现出来。此外，动脉粥样硬化等心血管疾病是全球死亡的主要原因。一些危险因素与这些疾病的发生和表现有关。
动脉粥样硬化的诊断通常是侵入性的。寻找新的、有效的方法来识别易发生动脉粥样硬化的个体是非常必要的。生物信息学分析一直试图通过更有效和更少侵入性的方法来完成这一任务，治疗心血管疾病[6]。动脉粥样硬化所表现出的难以置信的复杂遗传特征使这种方法的发展变得困难和耗时。
内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是作为心血管疾病生物标志物研究的最重要的基因之一。eNOS编码基因位于7号染色体上，负责一氧化氮的产生。该化合物具有亲脂性，并参与许多细胞内稳态过程[7-9]。一氧化氮还控制血管张力[10]、细胞增殖[11]、免疫系统细胞与发生炎症反应的动脉壁的粘附[12]和血小板聚集[13]。eNOS基因编码序列和eNOS蛋白氨基酸序列的突变可能影响内皮功能[14]。缺乏适当水平的一氧化氮会增加活性氧(ROS)的产生和释放，活性氧会导致内皮损伤，并与几种心血管疾病有关，如动脉粥样硬化[15]、冠状动脉疾病[16]、糖尿病[17]和梗死[18]。
他汀类药物被广泛应用于心血管疾病高危人群的预防。阿托伐他汀是一种常用的他汀类药物，用于治疗血脂水平高的患者。最常见的副作用是恶心、腹泻、心脏灼烧、关节和肌肉疼痛、横纹肌溶解、肝脏和肾脏问题以及糖尿病。与一般的他汀类药物类似，阿托伐他汀抑制HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶)，该酶参与胆固醇的产生。
这里，我们用anin-silico预测eNOS蛋白的调节肽以提高一氧化氮的生成。阿托伐他汀治疗动脉粥样硬化患者也有类似的效果。我们假设，使用设计的肽将导致一种有效的治疗，对动脉粥样硬化患者很少或没有副作用。为了未来的展望，一种调制肽的测定方法正在设计，以便在体外和体内进行测试，以便可能被用作一种新的治疗药物。
对eNOS三维结构的预测采用I-TASSER(迭代线程装配优化)服务器[21]建模。建模过程是基于之前解析的蛋白质结构的同源模板，并存入PDB(蛋白质数据库)。通过蒙特卡罗计算模拟对预测的eNOS结构进行折叠识别，通过PSSpred (protein secondary structure Prediction，蛋白质二级结构预测)确定蛋白质的二级结构[22,23]。利用SPICKER[24]进行构象和能量聚类，以确定最接近的原生结构，并使用分子动力学作为细化。
利用可视化软件PyMol (https://pymol.org)分析eNOS的结构，突出多态残基，最后设计调节eNOS构象和功能的肽段。通过KFC2[25]服务器预测了显著有助于蛋白质和肽之间结合的自由能和相互作用的稳定性的氨基酸残基。这种氨基酸残基的识别取决于这些氨基酸周围环境的物理和化学性质。丙氨酸扫描突变被认为是预测蛋白质结构中的热点。热点评分取决于构象(评分a)和化学性质(评分b)。通过dbSNP(单核苷酸多态性数据库)识别了eNOS和p53蛋白的临床重要多态残基。
基因和蛋白质eNOS都控制着一氧化氮的产生。一氧化氮的释放对几种生理条件[26]有积极影响，如血管张力[27]、凋亡[28]和血小板聚集[29]以及疾病，如几种癌症[30]和血管疾病[31,32]。研究人员一直在使用硅片入路，以促进新的诊断和治疗方法的发展[33,34]。对蛋白质与药物相互作用结合袋中作为热点的重要氨基酸残基的预测，对靶蛋白功能和构象的调节肽的设计有一定的指导意义[34-36]。热点簇区域的多态性改变了蛋白质的稳定构象，并可能增加心血管疾病的易感性[37]。目前的生物信息学方法允许设计两个调节肽(肽185和肽207)来稳定eNOS蛋白及其在动脉粥样硬化中的功能。
图1显示了设计的多肽在eNOS结构上的预测热点(表1)。预测是基于三种类型的相互作用能(静电，疏水和范德华)，调节蛋白质-肽复合物的稳定。静电力已被证明可以稳定蛋白质和蛋白质复合物的构象[38,39]，并可能影响疾病的发生和进展[40]。此外，大多数基于疏水性和范德华的相互作用与蛋白质和配体的稳定有关，它们可以增强对他汀类药物的反应，改善心血管疾病的预后[41]。
表1。预测热点氨基酸残基有助于稳定eNOS蛋白，以维持其功能和一氧化氮的产生
热点残* |
结构分 |
|
R170 |
0.36 |
0.04 |
F105 |
0.63 |
0.04 |
W244 |
1.38 |
0.29 |
W322 |
1.46 |
０．２５ |
L326 |
0.6 |
0.14 |
0.06 |
||
D478 |
1.37 |
0.01 |
W480 |
1.28 |
0.29 |
R474 |
0.99 |
0.14 |
*通过KFC2[25]进行预测。
数字1．eNOS蛋白和根据调控肽结合预测的热点。对eNOS结构(紫色)上热点残基(黄)的预测是基于与调节肽的相互作用，该肽旨在根据其调节一氧化氮产生和释放的能力稳定蛋白质的构象。使用阿托伐他汀等他汀类药物也能达到同样的效果
通常，热点以簇的形式出现，为了使蛋白质-药物之间的相互作用以更稳定的方式进行，在这些区域周围设计调制肽。在目前的工作中，我们发现热点像通常一样形成集群，并有助于eNOS和肽之间相互作用的稳定性(表1)。
残基R70和R474被预测为一个热点(表1)。精氨酸(R)是一种两亲性残基，经常出现在蛋白质表面，允许它与其他有机分子相互作用。这一事实使得该氨基酸在几个与疾病相关的蛋白质[43]中扮演着重要的热点角色。R残基参与蛋白质和靶分子(如药物和多肽)之间的极性结合。此外，该氨基酸还经常通过静电作用力[44]与其他几种蛋白质的残基相互作用，在有机分子相互作用时充当静电黏附力[45]。在我们的实验中，R热点残基与同一多肽链附近的残基以及设计肽(肽185)中的氨基酸建立了极性相互作用(图2A)。因此，R70作为热点残基对eNOS的稳定性至关重要，它通过4 Å范围内的键与肽185建立联系(图2B)。
数字2．eNOS的R70和F105与185肽的相互作用。（A)图像显示eNOS表面为紫色，KFC2[25]预测残留的热点为黄色。肽185用蓝色表示。这个小分子有助于稳定eNOS构象并维持其活性。(B) eNOS的卡通表示，显示R70和F105的结构以及它们与肽185的相互作用。R70和F105建立的键的距离分别在4和3 Å的范围内
残基Q(谷氨酰胺)476(图3)，D(天冬氨酸)478和W(色氨酸)480也有助于稳定eNOS与多肽相互作用的构象。图3A显示了肽在残基簇附近的分布情况。组氨酸残基也形成了这种热点簇(数据未显示)，并显著降低相互作用的自由能，在蛋白质参与的生物功能中起着重要作用[46,47]。由于组氨酸残基的生物化学性质，在蛋白质分子间的相互作用中发挥着多种作用。组氨酸能够调节带正电荷或负电荷氨基酸的静电系数。这种能力对于蛋白质[48]的稳定性和治疗肽[49]的设计至关重要。此外，亮氨酸和色氨酸残基(定义为eNOS与小分子或他丁类药物结合的热点)通过极性相互作用有助于蛋白质构象和结合能的稳定，这一特性也被证明发生在组氨酸残基上[48,49]。
数字3.．eNOS的R474和Q476与185肽之间的相互作用。（A)图片显示的是eNOS表面的另一个视图(紫色)和热点预测残留物(黄色)。肽185用蓝色表示。(B) eNOS的卡通表示，显示了当R474和Q476直接与肽185相互作用时的结构。R474和Q476建立的键的距离在3 Å的范围内
R474和Q476残基有助于稳定eNOS的自由能，并主要通过静电亲键与肽183结合。进行这些相互作用的热点残基通过极性键[50]在大约3 Å的范围内对蛋白质和结合分子的分子间结合和聚集起着重要作用。此外，氨基酸天冬氨酸参与多种有机分子之间的相互作用，如多肽、蛋白质和rna[51]。色氨酸是目前方法中发现的另一个热点(表1)，它被认为是蛋白质-配体界面的共同成分，固定结合有机分子[52]的结构，稳定蛋白质[53]的结合位点。
通过我们的分析，色氨酸残基被归类为热点残基，有助于eNOS通过疏水相互作用与第二个设计肽(肽207)结合的自由能。疏水残基，如色氨酸，及其与相邻残基的结合有助于维持eNOS折叠，主要是因为它们的疏水性质和倾向于放置在蛋白质结构的空腔内，远离溶剂[54]。图4A显示了肽207的分布和它在蛋白裂孔中的位置，图4B显示了热点D478和W480残基如何与肽207的相邻残基相互作用。色氨酸与肽207在3 Å范围内建立了几个极性相互作用。
数字4．eNOS的D478和W480与肽207之间的相互作用。（A)图片显示的是eNOS表面的概貌(紫色)和预测残基的热点(黄色)与肽207(绿色)相连。(B) eNOS的卡通表示，显示D478和W480直接与肽207相互作用时的结构。建立这些残基的键的距离在3 Å的范围内
此外，疏水氨基酸残基影响二级β‐片的再折叠和稳定性[55-58]。在这里，W322位于β -片链中，我们假设它显著有助于稳定eNOS构象，模仿他汀类药物的作用，用于治疗动脉粥样硬化。取代这种氨基酸残基的单核苷酸多态性显示出临床相关性，因为它增加了心血管疾病的易感性，降低了用于细胞内和血管稳态的一氧化氮水平。
据我们所知，虽然有几项研究试图设计eNOS蛋白的调节肽，但没有一项研究旨在设计小分子来替代成熟的动脉粥样硬化他汀类药物治疗[60-65]。
心血管疾病是全球死亡的主要原因。饮食习惯、遗传和环境因素与梗死、动脉粥样硬化和高血压的易感性密切相关。生物信息学方法投资于蛋白质结构建模、相互作用网络和小活性分子设计，以改进诊断和治疗技术。在这里,一个in-silico我们设计了两个小活性肽，以稳定eNOS，并保证其正常的一氧化氮生产功能水平。我们假设，使用设计的肽可以作为他汀类药物(如阿托伐他汀)的替代品，对动脉粥样硬化患者产生有效的治疗，且副作用较少或无副作用。为了未来的展望，一种调制肽的测定方法正在设计，以便在体外和体内进行测试，以便可能被用作一种新的治疗药物。
研究文章
收稿日期:2019年7月23日
录用日期:2019年12月16日
出版日期:2019年12月19日
席尔瓦KSF©2019。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可协议(Creative Commons Attribution License)发布，该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
一种调节肽稳定了动脉粥样硬化患者的eNOS蛋白，类似于阿托伐他汀。中华血管科学杂志，4:doi: 10.15761/VDT.1000166。
生物科学研究所，联邦大学Goiás, UFG, GO，巴西
表1。预测热点氨基酸残基有助于稳定eNOS蛋白，以维持其功能和一氧化氮的产生
热点残* |
结构分 |
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R170 |
0.36 |
0.04 |
F105 |
0.63 |
0.04 |
W244 |
1.38 |
0.29 |
W322 |
1.46 |
０．２５ |
L326 |
0.6 |
0.14 |
0.06 |
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D478 |
1.37 |
0.01 |
W480 |
1.28 |
0.29 |
R474 |
0.99 |
0.14 |
*通过KFC2[25]进行预测。
数字1．eNOS蛋白和根据调控肽结合预测的热点。对eNOS结构(紫色)上热点残基(黄)的预测是基于与调节肽的相互作用，该肽旨在根据其调节一氧化氮产生和释放的能力稳定蛋白质的构象。使用阿托伐他汀等他汀类药物也能达到同样的效果
数字2．eNOS的R70和F105与185肽的相互作用。（A)图像显示eNOS表面为紫色，KFC2[25]预测残留的热点为黄色。肽185用蓝色表示。这个小分子有助于稳定eNOS构象并维持其活性。(B) eNOS的卡通表示，显示R70和F105的结构以及它们与肽185的相互作用。R70和F105建立的键的距离分别在4和3 Å的范围内
数字3.．eNOS的R474和Q476与185肽之间的相互作用。（A)图片显示的是eNOS表面的另一个视图(紫色)和热点预测残留物(黄色)。肽185用蓝色表示。(B) eNOS的卡通表示，显示了当R474和Q476直接与肽185相互作用时的结构。R474和Q476建立的键的距离在3 Å的范围内
数字4．eNOS的D478和W480与肽207之间的相互作用。（A)图片显示的是eNOS表面的概貌(紫色)和预测残基的热点(黄色)与肽207(绿色)相连。(B) eNOS的卡通表示，显示D478和W480直接与肽207相互作用时的结构。建立这些残基的键的距离在3 Å的范围内
